与一组基因相关的贲门腺癌辅助诊断试剂盒

摘要

与一组基因相关的贲门腺癌辅助诊断试剂盒，属于生物医学和分子生物学技术领域，具体是指一种用于辅助诊断贲门腺癌的ELISA试剂盒，包括固相载体和6种被分别包被于固相载体上的抗体，6种抗体分别为：BCL2L1抗体、DLC1抗体、CDKN2A抗体、CDKN2B抗体、NRG1抗体、Erb B4抗体。实验证实，这组相关基因表达产物在贲门腺癌患者的血清中高表达，通过ELISA试剂盒检测人体血清中相关基因的表达水平，其检测结果可用于贲门腺癌的早起筛查、预后评估等辅助诊断，有具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种通过检测一组基因表达水平来早期筛查或辅助诊断贲门腺癌的试剂盒，属于生物医学和分子生物学技术领域。

背景技术

贲门腺癌(Gastric CardiaAdenocarcinoma，GCA)是位于人贲门解剖位置的一种恶性肿瘤，它危及人们生活质量和生命，给患者家庭和国家带来了沉重的负担。过去几十年间，GCA在我国高发区的发病率呈逐年上升趋势，提高了七倍，比其他恶性肿瘤的发病率更高。我国的河南省是全世界贲门腺癌发病率最高的地区，达到190/10万，而且这个发病率仍然在上升。

先前的研究已经发现了几个与GCA发生发展相关的风险因素，包括生活方式(吸烟、喝刺激性饮料、吃饭不规则)和疾病状况(肥胖、胃肠道炎症、胃食管返流、幽门螺杆菌感染)。由于GCA的组织病理学符合腺癌，但明显不同于食管鳞癌；并且，其另一显要流行病学特性是与胃远侧肿瘤的不完全等同性，故不能简单得归类于胃癌。因此，近年来人们常常将贲门腺癌作为单独的恶性肿瘤进行研究，并加大了对其分子学基础的研究。此外，我国的GCA与欧美食管胃交界部腺癌发病机制也明显不同，欧美的食管胃交界部腺癌与胃食管反流导致的Barret食管具有显著相关性，而我国贲门腺癌常与肠上皮化生等机制有关，中西方研究成果共享困难。

由于GCA早期缺乏特异症状，确诊比较困难，绝大多数患者获得诊断时已到中晚期，失去根治手术机会。尽管近年来GCA治疗技术有了很大提高，采取了手术、放疗和化疗、分子靶向治疗等多学科综合治疗措施，但其治愈率并没有明显改善，总的5年生存率仍小于20％。相反，早期诊断的贲门腺癌进行手术后生存率则可以大幅度提高。可见，早发现、早期诊断对贲门腺癌的治疗及预后具有重要的临床意义。目前其检出方式主要依赖于内镜检查，由于属于侵入性诊疗方式，而且其对内镜医生技术要求较高，难以用于自然人群大规模普查。所以，寻找特异性肿瘤标志物，缩小内镜筛查范围，是目前所要解决的首要问题。而传统的肿瘤标志物多存在特异性、敏感性低等缺点，难以广泛应用于临床。因此，寻找新的特异性肿瘤标志物显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的旨在提供能够对应检测多个贲门腺癌相关基因表达的一组分子的新用途，同时提供一种用于辅助诊断贲门腺癌的ELISA试剂盒。

基于上述目的，本发明采取了如下技术方案：

能够特异性检测BCL2L1、DLC1、CDKN2A、CDKN2B、NRG1和Erb B4表达水平的一组分子在贲门腺癌辅助诊断试剂或试剂盒中的应用，其中，相应基因表达水平的检测可以是基因层面的，也可以是蛋白层面的，例如，检测BCL2L1的表达水平，包括检测BCL2L1的基因表达水平，或者BCL2L1的蛋白表达水平。

所述应用中的分子为核酸或蛋白质。

所述蛋白质为抗体。

所述应用中的检测是指通过免疫组织化学法进行的检测。

或者，所述检测指通过酶联免疫吸附法进行的检测。

一种用于辅助诊断贲门腺癌的ELISA试剂盒，包括固相载体和6种被分别包被于固相载体上的抗体，6种抗体分别为：BCL2L1抗体、DLC1抗体、CDKN2A抗体、CDKN2B抗体、NRG1抗体、Erb B4抗体。

所述ELISA试剂盒还包括样本稀释液、第二抗体、第二抗体稀释液、显色液、终止液以及洗涤液。

为进一步做定量检测，所述ELISA试剂盒还包括BCL2L1、DLC1、CDKN2A、CDKN2B、NRG1、Erb B4抗原标准品。

为进一步做定性检测，所述ELISA试剂盒还包括阴性对照血清。

本专利发明人通过对大量样本进行研究发现，一组贲门腺癌相关基因(BCL2L1、DLC1、CDKN2A、CDKN2B、NRG1、Erb B4)在贲门腺癌组织中均高表达，敲低BCL2L1、DLC1、CDKN2A、CDKN2B、NRG1、Erb B4对于贲门腺癌细胞生长有明显的抑制作用，提示BCL2L1、DLC1、CDKN2A、CDKN2B、NRG1、Erb B4在贲门腺癌的发生发展过程中可能十分重要。基于BCL2L1、DLC1、CDKN2A、CDKN2B、NRG1、Erb B4表达水平检测的试剂盒，可用于贲门腺癌的辅助诊断、疗效预测及预后判断等。

BCL2L1基因可表达BCL2-like protein-1(BCL2L1)蛋白，属于BCL-2蛋白家族成员，是有效的细胞死亡抑制剂，能够抑制半胱天冬酶的活化。似乎通过阻断电压依赖性阴离子通道(VDAC)与其结合并阻止半胱天冬酶活化剂CYC1从线粒体膜释放来调节细胞死亡。在有丝分裂期间还充当G2检查点和进展为胞质分裂的调节剂。同种型Bcl-X(L)还调节突触前可塑性，包括神经递质的释放和恢复，轴突线粒体的数量以及突触小泡簇的大小和数量。在突触刺激期间，通过调节线粒体膜ATP合酶F1F0活性来增加线粒体的ATP利用率，并通过与DMN1L结合并刺激其在突触小泡中的GTP酶活性来调节海马神经元中的内吞囊泡回收。可减轻炎症，损害NLRP1-炎性体激活，从而CASP1激活和IL1B释放同种型Bcl-X(S)促进细胞凋亡。

肝癌缺失基因1(deleted in liver cancer 1，DLC1)由Yuan等在原发性肝癌中首次分离和报道，在多种恶性肿瘤细胞中为高表达。DLC1基因定位在人类第8号染色体p21.3～22位置，其c DNA长度是3.8kb，携带1091个氨基酸的编码信息。DLC1基因可以编码一个相对分子质量为123kDa的蛋白，此蛋白由3个主要的功能结构域组成，分别是：位于N端的SAM结构域(sterile alpha motif)、中间部分的Rho GAP(Rho GTPase-activating protein)和C端的START结构域(steroidogenic acute regμLatoryrelated lipidtransferdomain)。其中Rho GAP结构域是DLC1的催化功能区域，是DLC1发挥抑制肿瘤作用的主要基团，能够通过加速GTP的水解调控分子开关Rho GTPase的活性；SAM结构域主要调节蛋白与蛋白间的相互作用；START结构域可通过促进微丝的解聚和与小窝蛋白的相互作用调节迁移。DLC蛋白家族还有DLC2和DLC3两个蛋白，其结构与DLC1类似。

CDKN2A基因座，即INK4A/ARF基因定位于人类第9号染色体短臂2区1带(9p21)，由三个外显子(Exon1a、Exon2、Exon3)和两个内含子组成，三个外显子共同编码分子量为16kD的p16INK4A，即RB分子通路的启动因子。p16基因又称多肿瘤抑制基因(MTS1)或细胞周期素激酶抑制基因(CDKN)，由Kamb等于1994年发现。p16蛋白可与细胞周期素D1(cyclin D1)蛋白竞争结合CDK4，当p16与CDK4结合后，抑制了CDK4活性，使RB蛋白脱磷酸化，从而阻止细胞从G1期进入S期，抑制细胞增殖，对细胞周期进行负调控。INK4A存在可变读码框架(alternative reading frame，ARF)，它与INK4A共享Exon2和Exon3，取代Exon1a的是位于其上游约20kb的Exon1β，三个外显子共同编码分子量为14k D的蛋白即p14ARF。大多数学者认为：p14ARF发挥肿瘤抑制作用是通过加速癌蛋白MDM2的降解，恢复和稳定细胞野生型p53水平，增强p53的G1/S期卡点效应，从而抑制细胞生长。同时也有研究认为：p14ARF除了p53依赖性通路外，还存在着另一条非依赖于p53的通路，亦发挥重要的肿瘤抑制作用。

大量研究已显示多种人类肿瘤中均存在p16INK4A基因的失活，p16INK4A基因在DNA水平上的失活方式主要有三种：缺失、点突变、甲基化。在结肠癌及膀胱癌中，p16INK4A以Cp G岛甲基化引起的基因失活为主，在其他肿瘤如小细胞肺癌中p16INK4A的失活则常与缺失和点突变有关。但不论是哪一种方式导致的DNA失活最终都会引起p16INK4A蛋白表达减少甚至不表达，从而引起肿瘤生物学行为的改变。

p14ARF基因的失活机制与p16INK4A基因极为相似。尽管两者的表达均随着肿瘤病理分级及临床分期的升高而下降，但p14ARF的表达缺失和膀胱癌的病理分级、临床分期的相关性更密切。提示p14ARF的缺失对膀胱癌浸润性进展的作用更大。两者的相关分析也证明：尽管CDKN2A基因座编码的两种抑癌蛋白p16INK4A和p14ARF结构相似，它们在不同病理分级和临床分期膀胱癌中的表达却并不密切。预后分析证明两者的高表达往往提示预后不良，但最终有待于进一步深入的大样本临床研究来证实。

细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2B(cyclin-dependent kinase inhibitor 2B，CDKN2B)基因编码蛋白p15INK4B，为细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)抑制因子。p15INK4B与CDK4和CDK6相互作用形成复合物，阻断这两个关键激酶的活化，从而阻止细胞周期G1期的进程。CDKN2B基因启动子区包含的Sp1结合位点和Inr元件可介导TGFβ应答反应，包含的AP-1结合位点可介导Jun B对其表达调控。转录因子MIZ1直接结合并上调CDKN2B基因表达。不仅如此，上调MIZ1还能消除促癌转录因子Myc对CDKN2B基因表达的抑制作用。TGFβ也可解除Myc对CDKN2B的抑制作用。(BCL2L1、DLC1、CDKN2A、CDKN2B、NRG1、Erb B4)

NRG1位于人类染色体8p12，最初认识它作为一种神经调节蛋白，在神经系统的形成过程中发挥重要作用，促进神经系统的发育，抑制神经元凋亡，调节抑郁状态等。近来在肿瘤领域，在肿瘤的发生、发展、侵袭转移和凋亡的方面起着重要作用。应用流式细胞术检测上调NRG1对细胞凋亡的影响，结果显示NRG1组较Control组和NμLl组的细胞凋亡率明显增加。同样的现象在乳腺癌细胞MCF-7中也观察到。为进一步探讨NRG1促进凋亡的可能机制，应用Western blotting法检测Caspase-3、Bax和Bcl-2的表达。结果显示上调NRG1后，促进Caspase-3、Bax的表达，抑制Bcl-2的表达。Caspase-3作为凋亡通路的关键蛋白，与多条凋亡通路有关。Bax和Bcl-2作为线粒体途径的关键蛋白，调控细胞的凋亡，两者都为Bcl-2家族成员，其中Bax为促凋亡蛋白，Bcl-2为抗凋亡蛋白。有研究发现NRG-1为表皮生长因子受体(erythroblastic leukemia viral oncogene homolog，Erb B)家族的配体，NRG1-ErbB作用可以激活体内多条通路。有研究发现，NRG1的亚型HeregμLin通过下调Bcl-2，活化Caspase-7促进乳腺癌的凋亡。

Erb B4是唯一一种具有自主性的NRG1的特异性受体，它能够作为酪氨酸激酶与配体相互发生作用，并被配体活化。最近研究发现，在皮层敲除Erb B2和Erb B4受体，即完全阻断NRG-Erb B信号通路后，大鼠大脑树突棘的数目和形态受到影响。Erb B抑制剂对精分症模型的动物具有抗多巴胺作用，以此来减轻一些精神分裂症的行为缺乏。

NRG1-Erb B4这个信号转导通路能够调控神经发育和突触的可塑性，影响着多巴胺(DA)、谷氨酸(Glu)和γ-氨基丁酸(GABA)等多个神经递质系统。由NRG1、Erb B受体和下游的PI3K，AKt信号转导分子所组成的NRG1-Erb B信号通路系统，在神经元的增生、迁移和分化，神经突起的生长和轴突导向以及突触的形成和可塑性等过程中发挥着重要作用。已有研究表明，NRG1-Erb B4信号通路系统通过影响DA、Glu和GABA等多个神经递质系统、干扰神经元的迁移、影响轴突髓鞘化和抑制NMDA受体功能，导致谷氨酸功能低下等环节，参与了精神分裂症的发病过程，在精神分裂症的发生发展中起着重要的作用，调控NRG1-Erb B4信号通路可能成为精神分裂症治疗的一条新的药物作用靶点。

附图说明

图1是RT-PCR检测不同基因在贲门腺癌和癌旁组织中表达相对丰富的统计对比图，其中，图1-A对应BCL2L1基因，图1-B对应DLC1基因，图1-C对应CDKN2A基因，图1-D对应CDKN2B基因，图1-E对应NRG1基因，图1-F对应Erb B4基因；

图2是不同基因表达产物在贲门腺癌组织和癌旁组织的免疫组织化学染色评分统计对比图，其中图2-A对应BCL2L1基因，图2-B对应DLC1基因，图2-C对应CDKN2A基因，图2-D对应CDKN2B基因，图2-E对应NRG1基因，图2-F对应Erb B4基因；

图3是不同基因表达产物在贲门腺癌患者血清和健康志愿者对照血清的ROC曲线，其中，图3-A对应BCL2L1基因，图3-B对应DLC1基因，图3-C对应CDKN2A基因，图3-D对应CDKN2B基因，图3-E对应NRG1基因，图3-F对应Erb B4基因；

图4不同组基因表达产物的叠加在贲门腺癌患者血清和健康人血清中的ROC曲线。

具体实施方式

为了使本揭示内容的叙述更加详尽与完备，下文针对了本发明的实施方式与具体实施例提出了说明性的描述；但这并非实施或运用本发明具体实施例的唯一形式。实施方式中涵盖了多个具体实施例的特征以及用以建构与操作这些具体实施例的方法步骤与其顺序。然而，亦可利用其它具体实施例来达成相同或均等的功能与步骤顺序。

除非本说明书另有定义，此处所用的科学与技术词汇的含义与本发明所属技术领域中具有通常知识者所理解与惯用的意义相同。

在本揭示内容中，所述“肿瘤(neoplasm)”一词是指异常新生的细胞或生长速度较正常细胞快的异常生长细胞。肿瘤会产生良性或恶性的无结构团块(肿块)。所谓“良性(benign)”是指非癌性的瘤或肿瘤，如，其细胞不会侵袭周边组织或转移至远处；而“恶性”则是指转移性瘤或肿瘤，其可侵袭周边组织且不受正常细胞生长控制。

在本文中“癌(cancer)”一词是指动物中所有类型的癌症或恶性瘤或肿瘤。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用的试剂可以商业购买得到。

实施例中未注明具体条件的实验方法，通常为本领域常规方法，如按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆，实验手册(第三版)(科学出版社，2002)中的所述条件，或按照试剂制造厂家所建议的条件。

所有实例均来源于基于发明人所在研究机构35年来搜集的30余万例贲门腺癌患者相关信息进行筛选后研究得到的结果。

实施例1标本的准备

1.1标本来源

从安阳市肿瘤医院2014年10月到2017年12月期间确诊为贲门腺癌的患者中筛选651例纳入患者组。纳入标准如下：

(1)接受外科手术切除的病例；

(2)术后病理确诊为贲门腺癌并有相应的癌旁组织，癌旁组织定义为距肿瘤边缘5cm以外的贲门组织；

(3)病人均未接受过术前新辅助治疗。

选取同等数量的健康志愿者作为编为健康志愿者组。“健康志愿者”的定义为经过胃镜检查未发现任何上消化道病理性改变包括阳性改变的志愿者。

1.2患者组组织标本

患者组病例经手术切除贲门腺癌组织后，在病理科医生的指导下立即取贲门腺癌及癌旁组织放入液氮，编号后置于-80℃低温冰箱中保存备用。

1.3患者组血清标本

抽取患者组病例血液，离心法分离出血清，除菌后加入0.1％的叠氮钠及半量的甘油，4℃保存于普通冰箱。

1.4健康志愿者组血清标本

抽取健康志愿者组志愿者血液，离心法分离出血清，除菌后加入0.1％的叠氮钠及半量的甘油，4℃保存于普通冰箱。

实施例2RT-PCR法研究贲门腺癌和癌旁组织中基因BCL2L1、DLC1、CDKN2A、CDKN2B、NRG1、Erb B4的表达差异

2.1实验方法

2.1.1对组织样本进行RNA提取

依编号分别对来源于实施例1患者组的贲门腺癌组织及对应的癌旁组织进行RNA提取，每个病例的贲门腺癌组织和对应的癌旁组织编为一组，贲门腺癌组织作为实验样本，对应的癌旁组织作为对照样本，651例病人编为651组。

采用Reagent(invitrogen，货号15596-018)对651组样本进行RNA提取，实验操作按产品说明书进行，每组实验的具体操作如下：

收集样本后冻存于液氮，取出后把组织样本放入已预冷的研钵中进行研磨，待组织样本成粉末状后：

(1)加入1mLTrizol，室温保存5分钟；

(2)加0.2mL氯仿，用力振荡离心管充分混匀，室温放置5-10分钟；

(3)12000rpm高速离心15分钟后吸取上层水相(吸70％)到另一新离心管中，注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质。移入新管，加入等体积的-20℃预冷异丙醇，充分颠倒混匀，置于冰上10分钟；

(4)12000rpm高速离15分钟后小心弃掉上清液，按1mL/mLTrizol的比例加入75％乙醇(DEPC水配制)洗涤沉淀(4℃保存)，振荡混合，4℃下12000rpm高速离心5分钟；

(5)弃去乙醇液体，室温下放置5分钟以充分晾干沉淀，加入DEPC水溶解沉淀；

(6)用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，冻存于-80℃。RNA质量判定标准：RNA样本的OD260/OD280值为1.7-2.2之间；总RNA电泳图谱有清晰的28S、18S条带；70℃水浴保温1小时后的电泳图谱与水浴保温前的图谱无明显差异。

2.1.2RNA样品的质量分析

RNA提取后琼脂糖凝胶电泳，从电泳结果可以初步判定提取的RNA样品质量合格与否，是否可以用于进一步的转录组分析。进而通过NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品的提取情况，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。

2.1.3逆转录合成cDNA

采用III Reverse Transcriptase进行cDNA反转录，实验操作按产品说明书进行。

2.1.4配制qRT-PCR反应体系：

2.1.5扩增循环

DNA变性(90℃-96℃)：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。

退火(25℃-65℃)：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。

延伸(70℃-75℃)：在Taq酶的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。

2.2实验结果

实时定量PCR扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增效率相近，极限平而无上扬现象，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本扩增产物溶解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增。

根据qRT-PCR的相对定量公式比较基因在贲门癌组织和癌旁组织中的表达水平。

采用统计学软件SPSS 17.0对获得的数据进行统计学分析，应用Mann–Whitney U检验比较基因在贲门腺癌组织与癌旁正常贲门组织中表达的差异，p＜0.001，表示差异性极显著。从SPSS 17.0中导出数据，采用Graphpad Prisma 8.0作图，如图1所示，从图中可以看出，本发明研究的6个基因在贲门腺癌组织中的总体表达水平均高于癌旁组织，提示可能具有很好的贲门腺癌辅助诊断价值。

实施例3通过免疫组织化学染色法研究贲门腺癌和癌旁组织中基因BCL2L1、DLC1、CDKN2A、CDKN2B、NRG1、Erb B4的表达差异

3.1组织染色

取患者组651例患者的贲门腺癌组织和癌旁组织标本分别做如下处理：

将标本用4％多聚甲醛常温固定24h～72h，石蜡包埋，制成5mm的切片。石蜡切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水后，置于0.3％H₂O₂-甲醇溶液中室温孵育30min以消除内源性过氧化物酶活性，蒸馏水清洗，微波法抗原修复，磷酸盐缓冲液(PBS)浸泡5min，置于1∶10山羊血清封闭液中室温孵育10min。

将每个通过以上步骤处理后得到的样本随机分为六份，分别加入对应BCL2L1蛋白、DLC1蛋白、CDKN2A蛋白、CDKN2B蛋白、NRG1蛋白、Erb B4蛋白(基因的表达产物)的兔抗人多克隆抗体(1∶100稀释)4℃过夜，加入生物素标记的二抗和辣根过氧化物酶标记链霉卵白素37℃抚育30min，二氨基联苯胺(DAB)显色，水洗，苏木素复染，梯度乙醇脱水、二甲苯透明后，树胶封片，在光学显微镜下观察全片，在400倍的高倍镜下观察并从阳性细胞的频率对切片进行评分。

3.2评分

阳性细胞的频率被定义为：少于5％，0分；5％-25％，1分；26％-50％，2分；51％-75％，3分；大于75％，4分。

3.3实验结果

分别对各基因表达产物在贲门腺癌组织和癌旁组织的免疫组织化学染色评分进行统计并作图，如图2所示。从图2可以看出，基因BCL2L1、DLC1、CDKN2A、CDKN2B、NRG1以及Erb B4在贲门腺癌组织中的表达量均显著高于癌旁组织。

实施例4基于检测基因BCL2L1、DLC1、CDKN2A、CDKN2B、NRG1、Erb B4表达水平的ELISA试剂盒，以及将之用于贲门腺癌诊断的受试者工作特征曲线

为了探究检测基因BCL2L1、DLC1、CDKN2A、CDKN2B、NRG1、Erb B4的表达水平能否作为贲门腺癌诊断的依据，在测试阶段本发明应用ELISA检测方法，对实施例1所列的651例患者组血清样本以及健康志愿者组的651例正常对照血清样本分别进行了BCL2L1、DLC1、CDKN2A、CDKN2B、NRG1、Erb B4表达水平检测。

4.1抗体的包被

用50mM的碳酸盐包被缓冲液(pH9.6)将六种商品化的抗体(BCL2L1抗体、DLC1抗体、CDKN2A抗体、CDKN2B抗体、NRG1抗体、Erb B4抗体)稀释至蛋白质含量为5μg/ml的抗体包被液。

取96孔聚苯乙烯板，按照表1所列布局方式向反应孔中加入抗体包被液，每孔0.1ml，4℃过夜。

表1各抗体在96孔板中的布局

123456789101112ABCL2L1BCL2L1BCL2L1BCL2L1BCL2L1BCL2L1BCL2L1BCL2L1BCL2L1BCL2L1BCL2L1BCL2L1BDLC1DLC1DLC1DLC1DLC1DLC1DLC1DLC1DLC1DLC1DLC1DLC1CCDKN2ACDKN2ACDKN2ACDKN2ACDKN2ACDKN2ACDKN2ACDKN2ACDKN2ACDKN2ACDKN2ACDKN2ADCDKN2BCDKN2BCDKN2BCDKN2BCDKN2BCDKN2BCDKN2BCDKN2BCDKN2BCDKN2BCDKN2BCDKN2BENRG1NRG1NRG1NRG1NRG1NRG1NRG1NRG1NRG1NRG1NRG1NRG1FErbB4ErbB4ErbB4ErbB4ErbB4ErbB4ErbB4ErbB4ErbB4ErbB4ErbB4ErbB4GH

次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液(含1％BSA,0.05％吐温20BPS)洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。

4.2试剂盒构成

(1)4.1制备的包被了BCL2L1抗体、DLC1抗体、CDKN2A抗体、CDKN2B抗体、NRG1抗体、Erb B4抗体的96孔板；

(2)样本稀释液：PBST(含1％BSA,0.05％吐温20的PBS)，1.5mL；

(3)酶标第二抗体：HRP标记抗六种自身抗体对应IgG(抗BCL2L1自身抗体、抗DLC1自身抗体、抗CDKN2A自身抗体、抗CDKN2B自身抗体、抗NRG1自身抗体、抗Erb B4自身抗体)，亲合纯化，各0.4mL；

(4)第二抗体稀释液：PBST(含1％BSA,0.05％吐温20的PBS)，1.5mL；

(5)显色液：TMB底物液，1.5mL；

(6)终止液：2M硫酸，5mL；

(7)洗涤液：PBST(含1％BSA,0.05％吐温20的PBS)，5mL。

4.3基因表达水平的检测

(1)加样：加入样本稀释液按照1:50的比例对血清样本进行稀释，按照12μL/每孔的量加入反应孔中，置37℃孵育1小时，然后洗涤。同时留空白孔。

(2)加酶标第二抗体：利用第二抗体稀释液对酶标第二抗体进行稀释，经滴定后的稀释度1:100；于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体4μL。37℃孵育1小时。

(3)洗涤：真空泵抽吸干孔内反应液，随后于各反应孔中注满洗涤液并放置2分钟，间歇摇动30秒，真空泵抽吸干孔内洗涤液。洗涤5次。

(4)加底物液显色：于各反应孔中加入TMB底物溶液15μL，37℃反应30分钟。

(5)终止：于各反应孔中加入50μL 2M硫酸溶液终止反应。

(6)结果判定：在ELISA检测仪上于405nm波长处，以空白对照孔调零后测各孔吸光度值。

4.3实验结果

所有结果在读取时采取随机双盲的方式，针对在患者组和健康志愿者组测量所得的吸光度值全部评估其敏感性和特异性。

4.3.1为初步判断六种基因表达水平对于贲门腺癌患者的鉴别能力，本发明对贲门腺癌患者组与正常对照组进行了ROC线分析，如图3所示，结果分析如下：

BCL2L1基因表达产物贲门腺癌对正常人的曲线下面积为0.616，(95％CI0.5602to0.6717，Pvalue<0.0001)；

DLC1基因表达产物贲门腺癌对正常人的曲线下面积为0.6767，(95％CI 0.6239to0.7295，Pvalue<0.0001)；

CDKN2A基因表达产物贲门腺癌对正常人的曲线下面积为0.7017，(95％CI0.6486to 0.7549，Pvalue<0.0001)；

CDKN2B基因表达产物贲门腺癌对正常人的曲线下面积为0.7217，(95％CI0.6713to 0.7721，Pvalue<0.0001)；

NRG1基因表达产物贲门腺癌对正常人的曲线下面积为0.6494，(95％CI 0.5957to0.7031，Pvalue<0.0001)；

Erb B4基因表达产物贲门腺癌对正常人的曲线下面积为0.6606，(95％CI 0.6063to0.7148，Pvalue<0.0001)。

4.3.2针对几种基因的表达水平联合后对于贲门腺癌患者的鉴别能力，本发明对贲门腺癌患者组与正常对照组进行了ROC线分析，如图4所示，结果分析如下：

联合检测BCL2L1+CDKN2A+CDKN2B蛋白表达水平，贲门腺癌对正常人的曲线下面积为0.8198，(95％CI 0.7792to 0.8604，P value<0.0001)；

联合检测DLC1+NRG1+Erb B4蛋白表达水平，贲门腺癌对正常人的曲线下面积为0.821，(95％CI 0.7807to 0.8614，P value<0.0001)；

联合检测BCL2L1+DLC1+CDKN2A+CDKN2B+NRG1+Erb B4蛋白表达水平，贲门腺癌对正常人的曲线下面积为0.9108，(95％CI 0.8835to 0.9382，P value<0.0001)。

图4及上述分析结果显示，联合检测BCL2L1、DLC1、CDKN2A、CDKN2B、NRG1、Erb B4六种基因蛋白的表达水平，其ROC曲线下面积明显高于其中的三指标或四指标检测的ROC曲线面积，提示联合检测用于贲门腺癌的诊断具有更大的价值。

虽然上文实施方式中揭露了本发明的具体实施例，然其并非用以限定本发明，本发明所属技术领域中具有通常知识者，在不背离本发明的原理与精神的情形下，当可对其进行各种更动与修饰，因此本发明的保护范围当以附随申请专利范围所界定者为准。