法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2020-07-07
授权
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2019-10-22
实质审查的生效 IPC(主分类):G01N27/327 申请日:20190717
实质审查的生效
2019-09-24
公开
公开
技术领域
本发明涉及电化学检测技术领域,具体提供了一种利用DSN酶和DNAzyme的DNA自组装电化学生物传感器的制备方法。
背景技术
microRNA是一种小的非蛋白编码RNA分子,通过与靶mRNA中的合成序列结合,从而抑制转录后基因表达。microRNA在许多生物学过程中发挥着重要的作用,并与各种疾病,尤其是癌症相关。microRNA被认为是癌症诊断、预后和治疗监测的潜在生物标志物。因此,开发灵敏度高、选择性好的检测策略是生物医学研究的迫切需求,尤其是对癌症的早期诊断和药物新靶点的发现有重要意义。
目前,microRNA的传统检测方法主要有三种,定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)、诺瑟杂交(Northern blot)和高通量测序。qRT-PCR方法基于基因扩增阳离子技术,具有较高的检测灵敏度,但由于抑制剂、热误差和标本间交叉污染等直接影响检测结果的准确性,限制了qRT-PCR的进一步应用。而northern blotting和高通量测序,则需要进行一系列复杂的操作,耗时长,且检测灵敏度较低。
本发明公开了一种超灵敏的检测方法,利用双特异性核酸内切酶及和DNAzyme的DNA自组装电化学生物传感器的制备方法,并将其应用于肿瘤标志物microRNA的检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用双特异性核酸内切酶(DSN酶)和DNAzyme的DNA自组装电化学生物传感器的制备方法,并将其应用于肿瘤标志物microRNA的检测方法。所述方法是通过便捷,灵敏的信号放大策略,利用特异性核酸内切酶(DSN酶)和DNAzyme的特异性切割后进行DNA自组装形成电化学生物传感器用于目标检测。所建立的方法具有高的灵敏度,可用于复杂体系的microRNA的直接检测。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
包括以下步骤:首先设计能与目标microRNA碱基互补配对且含8-17DNAzyme序列的双功能探针H1;双特异性核酸内切酶特异性切割DNA-RNA杂交的DNA部分,H1探针被切割得到8-17DNAzyme序列,而microRNA被释放出来继续与未反应的H1探针杂交循环切割,实现第一次目标循环;然后将发夹探针H2固定在金电极上;当金属离子存在时,前述8-17DNAzyme会特异性识别H2 序列中腺嘌呤核糖核苷酸rA位点并特异性切割,H2探针被切断成两部分,一部分与电极相连,一部分为游离的碱基序列,同时释放8-17DNAzyme继续切割未反应的电极表面的H2探针实现第二次循环放大;电极表面的H2被DNAzyme切断后,依然有部分碱基序列固定在电极表面上,这部分碱基序列会与连接探针Link1和Link2、杂交探针H3和H4进行自组装,形成一条dsDNA链;最后,六氨合钌通过静电作用吸附在dsDNA骨架上,通过检测六氨合钌的电化学信号,实现对microRNA的超灵敏检测。
具体步骤为:
(1)针对目标microRNA设计功能探针H1,所述探针为发夹结构的DNA探针,序列结构为从5'端到3'端依次为颈部1、环部1、环部2、环部3、颈部2序列。所述的第一部分为自由序列颈部1和环部1序列,所述的第二部分环部2为能特异性识别目标microRNA并与之杂交的序列,所述第三组成部分环部3和颈部2碱基序列为8-17DNAzyme,能在金属Mg2+离子存在时,特异性识别固定在电极表面的捕获探针H2(该发夹探针5'端修饰巯基)并切割序列中腺嘌呤核糖核苷酸rA位点。
(2)双特异性核酸内切酶(DSN酶)特异性切割:将6μL含有不同浓度microRNA的DSN缓冲液加入装有4μL 5μM的双功能探针H1溶液的微量离心管中反应120min(其中DSN缓冲液包含:0.2U DSN,50 mM Tris-HCl,10mM MgCl2,1>
(3)电极预处理:将直径为2mm的金电极在新配制的食人鱼溶液(98%硫酸和30%双氧水按3:1的体积混合)浸泡,然后依次用0.3μm和0.05 μm的Al2O3粉末在抛光绒布打磨,然后用超纯水冲洗干净,分别在乙醇和超纯水中超声清洗5min,然后将电极置于0.5M的H2SO4溶液中,在-0.35-1.6V电位下扫描,直到在0.95V左右出现一个尖锐的还原峰,在0.12-0.14V范围内出现三个小的、连续的氧化峰,用超纯水冲洗电极,氮气吹干,备用。
(4)捕获探针H2的固定:在9μL含有500mM NaCl、1mM EDTA、10mM TCEP的pH 8.0、10mM Tris-HCl缓冲液中加入1μL 10μM捕获探针H2溶液,得到捕获探针H2固定液。将捕获探针H2固定液滴加到金电极表面,室温孵育120min,H2可通过S-Au键固定在电极表面,再用10mM pH 8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗电极表面,氮气吹干。
(5)电极表面空白位点封闭:将10μL 2μM的疏基己醇溶液滴加到步骤(4)所得电极表面,室温孵育120min,封闭电极表面的非特异性活性位点,用10mM pH 8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗电极表面,氮气吹干。
(6)8-17DNAzyme的切割循环:将步骤(2)微量离心管中的溶液滴加于步骤(5)处理好的电极表面,孵育90min,用10mM pH 8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗,氮气吹干。步骤(2)反应得到的8-17DNAzyme序列可以在金属Mg2+离子存在时,特异性识别固定在电极表面的H2探针形成杂交体,切割H2序列中腺嘌呤核糖核苷酸rA位点,>
(7)DNA自组装电化学生物传感器的构建:电极表面的H2被DNAzyme切断后,依然有部分碱基序列固定在电极表面上,这部分碱基序列会与连接探针Link1和Link2、杂交探针H3和H4进行自组装,形成一条dsDNA链。具体操作是将步骤(6)得到的电极用10mM pH 8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗吹干后,依次在电极表面滴加10μL含有1μM连接探针Link1缓冲液,10μL 1μM的连接探针Link2缓冲液,10μL含有0.5μM H3和0.5μM H4的杂交探针缓冲液,分别反应90min、90min和120min,超纯水冲洗,氮气吹干。
(8)电化学检测microRNA信号:将含有10μM六氨合钌的电化学检测液通氮气,步骤(7)所得电极置于电化学工作检测液中,电化学工作站在-0.6-0V电势范围内用方波伏安法扫描。
DNA预处理:所有探针在使用前要经过预处理。处理方法为将装有DNA序列的微量离心管在离心机中5000rpm,离心5min,加入适量默克水,得到DNA浓度为100μM的溶液,再用pH为8.0的Tris-HCl缓冲液稀释至10μM。具有发夹结构的DNA均在95℃加热5min,然后插入冰中半小时,使探针形成发夹结构。
双功能探针H1溶液的制备:5μL 10μM的H1探针溶液溶于5μL 的含200mM NaCl的pH8.0 100 mM Tris-HCl缓冲液。疏基己醇溶液的制备:取疏基己醇加至超纯水中,制成2mM的疏基己醇封闭剂,冰箱4℃保存,备用。
杂交探针缓冲液的制备:将0.5μL 10μM、的H3探针溶液和0.5μL 10μM的H4探针溶液溶于9μL 的含500mM NaCl、1mM MgCl2>
连接探针Link1缓冲液的制备:将1μL 10μM的Link1探针溶液溶于9μL 的含500mMNaCl、1mM MgCl2的pH>
连接探针Link2缓冲液的制备:将1μL 10μM的Link2探针溶液溶于9μL 的含500mMNaCl、1mM MgCl2>
DSN缓冲液:0.2U DSN (DSN酶溶于50% DSN storage buffer和50%甘油 )、50 mMTris-HCl,10mM MgCl2,1>
电化学检测液的制备:pH 8.0的10mM Tris-HCl中含有10μM六氨合钌,混匀,冰箱4℃保存,备用。
电化学工作站为CHI660C,采用三电极系统,工作电极是金电极,对电极是铂丝电极,参比电极是银/氯化银电极。冲洗电极所用缓冲液为Tris-HCl缓冲液。
本发明所用试剂均市售可得。
本发明适用于肿瘤细胞中microRNA-141的检测。
本发明的优点在于:
本发明提供的一种利用双特异性核酸内切酶(DSN酶)和DNAzyme切割循环的DNA自组装电化学生物传感器制备方法,巧妙设计实验方案,将生物信号转化为电化学信号,实现对目标物检测信号的多次放大,microRNA的检测限低至1fmol,实现了对肿瘤标志物microRNA-141的高灵敏检测。该检测方法具有高度的选择性,具有广阔的应用前景,具有高度特异性。
附图说明
图1.为本发明的构建流程示意图。
图2.为实施例中不同浓度目标物的电流响应。
图3.为实施例中不同浓度目标物的电流响应标准曲线图。
图4.为分析方法的特异性(a)空白、 (b) microRNA-200a、 (c) microRNA-429、(d)单碱基错配的microRNA -141和(e) microRNA-141的选择性。
具体实施方式
实施例1、检测待测样品中是否含有microRNA-141
图1为本发明的构建流程示意图
下面实施例采用microRNA-141为待测microRNA,microRNA-141的核苷酸序列为UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG。
一、待测样品
本发明的实施例采用的是浓度为1fM至10pM的一系列溶液作为待测样本,本发明的待测样本也可以来源于血浆或血清,具体方法如下:
所有电化学检测均在 CHI660C 电化学工作站上进行。三电极系统包括:完成 DNA 自组装的金电极(工作电极),铂丝电极(对电极),银-氯化银(Ag/AgCl)参比电极。电化学检测在六氨合钌(RuHex)溶液中进行。先将 RuHex 溶液通氮除氧 15 min,再将完成组装的电极浸泡其中2 min,使溶液中带正电的 RuHex通过静电作用吸附到带负电荷的 DNA 磷酸骨架上。然后用方波伏安法进行扫描,扫描电位范围-0.6 ~ 0 V,脉冲幅度 0.05 V,脉冲宽度0.05 s。
二、一种利用双特异性核酸内切酶(DSN酶)和DNAzyme切割循环的DNA自组装电化学生物传感器制备检测microRNA-141的方法
(1)针对目标microRNA设计双功能探针H1,所述探针为发夹结构的DNA探针;设计固定在电极表面的探针H2,该发夹探针5'端修饰巯基;
(2)双特异性核酸内切酶(DSN酶)特异性切割:将6μL含有不同浓度microRNA的DSN缓冲液加入装有4μL 5μM的双功能探针H1溶液的微量离心管中反应120min;使双特异性核酸内切酶特异性切割DNA-RNA杂交的DNA部分,得到8-17DNAzyme序列,并释放microRNA继续与其余未反应的H1探针杂交循环切割,实现目标循环放大;其中DSN缓冲液包含:0.2U DSN,50mM Tris-HCl,10mM MgCl2,1>
(3)电极预处理:将直径为2mm的金电极在新配制的食人鱼溶液浸泡,然后依次用0.3μm和0.05 μm的Al2O3粉末在抛光绒布打磨,然后用超纯水冲洗干净,分别在乙醇和超纯水中超声清洗5min,然后将电极置于0.5M的H2SO4溶液中,在-0.35-1.6V电位下扫描,直到在0.95V出现一个尖锐的还原峰,在0.12-0.14V范围内出现三个小的、连续的氧化峰,用超纯水冲洗电极,氮气吹干,备用;食人鱼溶液为98%硫酸和30%双氧水按3:1的体积混合;
(4)捕获探针H2的固定:在9μL含有500mM NaCl、1mM EDTA、10mM TCEP、pH 8.0的10mMTris-HCl缓冲液中加入1μL 10μM捕获探针H2溶液,得到捕获探针H2固定液;将捕获探针H2固定液滴加到金电极表面,室温孵育120min,H2可通过S-Au键固定在电极表面,再用10mMpH 8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗电极表面,氮气吹干;
(5)电极表面空白位点封闭:将10μL 2μM的疏基己醇溶液滴加到步骤(4)所得电极表面,室温孵育120min,封闭电极表面的非特异性活性位点,用10mM pH 8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗电极表面,氮气吹干;
(6)8-17DNAzyme的切割循环:将步骤(2)微量离心管中的溶液滴加于步骤(5)处理好的电极表面,孵育90min,用10mM pH 8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗,氮气吹干;
(7)DNA自组装电化学生物传感器的构建:将步骤(6)得到的电极用10mM pH 8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗吹干后,依次在电极表面滴加10μL含有1μM连接探针Link1缓冲液,10μL 1μM的连接探针Link2缓冲液,10μL含有0.5μM H3和0.5μM H4的杂交探针缓冲液,分别反应90min、90min和120min,超纯水冲洗,氮气吹干;
(8)电化学检测microRNA信号:将含有10μM六氨合钌的电化学检测液通氮气,再将步骤(7)所得电极置于电化学检测液中,电化学工作站在-0.6-0V电势范围内用方波伏安法扫描检测。
DNA预处理:所有探针在使用前要经过预处理。处理方法为:将装有DNA序列的微量离心管在离心机中5000rpm,离心5min,加入适量默克水,得到DNA浓度为100μM的溶液,再用pH为8.0的Tris-HCl缓冲液稀释至10μM。具有发夹结构的DNA均在95℃加热5min,然后插入冰中半小时,使探针形成发夹结构。
双功能探针H1溶液的制备:5μL 10μM的H1探针溶液溶于5μL 的含200mM NaCl的pH8.0 100 mM Tris-HCl缓冲液。
捕获探针H2固定液的制备:将含有1μL10μM的H2探针溶液溶于9μL 的含500mMNaCl、1mM EDTA、10mM TCEP的 pH 8.0 10mM Tris-HCl缓冲液。
疏基己醇溶液的制备:取疏基己醇加至超纯水中,制成2mM的疏基己醇封闭剂,冰箱4℃保存,备用。
杂交探针缓冲液的制备:将0.5μL 10μM的H3探针溶液和0.5μL 10μM的H4探针溶液溶于9μL 的含500mM NaCl、1mM MgCl2>
连接探针Link1缓冲液的制备:将1μL 10μM的Link1探针溶液溶于9μL 的含500mMNaCl、1mM MgCl2的pH>
连接探针Link2缓冲液的制备:将1μL 10μM的Link2探针溶液溶于9μL 的含500mMNaCl、1mM MgCl2>
DSN缓冲液:0.2U DSN (DSN酶溶于50% DSN storage buffer和50%甘油 )、50 mMTris-HCl,10mM MgCl2,1>
所述探针H1序列为:CACCCACTACCCATCTTTACCAGACAGTGTTACATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGGGTG;
所述探针H2为:SHCH2CH2CH2CH2CH2CH2TTTTTCCACCACATTCAAATTCACCAACTATrAGGAAGAGATGTTACGAGGCGGTGGTGG;
所述Link1序列为:CCA ACTAAC CCCATATAGTTGGTGAAT;
所述Link2序列为:ATGGGGTTAGTT GGATCGCCT CATACTGTCTCAAGG ACCACCGCAT;
所述H3序列为:TCTCAAGGACCACCGCAT CTCTAC ATGCGGTGGTCCTTGAGA CAGTATGAG GCGA;
所述H4序列为:GTAGAG ATGCGGTGGTCCTTGAGA TCGCCT CATACTG TCTCAAGGACCACCGCAT。
电化学检测液的制备:pH 8.0的10mM Tris-HCl中含有10μM的六氨合钌,混匀,冰箱4℃保存,备用。
电化学工作站为CHI660C,采用三电极系统,工作电极是金电极,对电极是铂丝电极,参比电极是银/氯化银电极。冲洗电极所用缓冲液为Tris-HCl缓冲液。
检测结果如图2所示,在1fM到10pM范围内,随着目标物浓度的增大,电化学信号增强,电流响应值增大。图3为本实施例的电流响应标准曲线。
实施例2
为了评估本发明方法的特异性,用相同的实施例1实验步骤对几条不同序列的microRNA(包含(a)空白 (b) microRNA-200a(序列UAACACUGUCUGGUAACGAUGU), (c)microRNA-429(序列UAAUACUGUCUGGUAAAACCGU),(d)单碱基错配microRNA-141(序列UAACACUGUCUCGUAAAGAUGG), (e) microRNA-141。microRNA-141的浓度为10pM 进行检测。
检测结果如图4所示, 10pM microRNA-141(e)产生的电化学信号明显高于其他样品。该结果表明,此方法具有很高的序列特异性,有望用于识别不同的microRNA序列。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰,皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福州大学
<120> 利用DSN酶和DNAzyme的DNA自组装电化学生物传感器的制备方法
<130> 6
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cacccactac ccatctttac cagacagtgt tacatctctt ctccgagccg gtcgaaatag 60
tgggtg 66
<210> 2
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tttttccacc acattcaaat tcaccaacta traggaagag atgttacgag gcggtggtgg 60
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccaactaacc ccatatagtt ggtgaat 27
<210> 4
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atggggttag ttggatcgcc tcatactgtc tcaaggacca ccgcat 46
<210> 5
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tctcaaggac caccgcatct ctacatgcgg tggtccttga gacagtatga ggcga 55
<210> 6
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gtagagatgc ggtggtcctt gagatcgcct catactgtct caaggaccac cgcat 55
机译: 具有造血球合酶活性的蛋白质或多肽,编码该蛋白质或多肽的DNA,利用该DNA的具有造血球合酶活性的蛋白质或多肽的制备方法,以及在含有该酶的碱基上编码核酸的核酸。
机译: 具有造血球合酶活性的蛋白质或多肽,编码该蛋白质或多肽的DNA,利用该DNA的具有造血球合酶活性的蛋白质或多肽的制备方法,以及在含有该酶的碱基上编码核酸的核酸。
机译: 新的羰基还原酶,包含编码酶的DNA的多核苷酸,其制备方法和利用其制备光学活性醇的方法