法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2020-03-31
授权
授权
2019-10-25
著录事项变更 IPC(主分类):A61K31/4178 变更前: 变更后: 申请日:20190307
著录事项变更
2019-08-06
实质审查的生效 IPC(主分类):A61K31/4178 申请日:20190307
实质审查的生效
2019-07-12
公开
公开
技术领域
本发明属于糖尿病外周动脉疾病技术领域,具体涉及亚硝基谷胱甘肽还原酶(GSNOR)抑制剂N6022的应用,尤其涉及在制备治疗糖尿病外周动脉疾病(PAD)药物中的应用。
背景技术
下肢外周动脉疾病(PAD)具有高患病率,在糖尿病人群中达20%~40%,随着年龄的增加,糖尿病者患PAD的风险增加2~4倍,是最重要的危险因素。PAD具有高致残率和死亡率,PAD导致的下肢动脉狭窄、闭塞引起严重肢体缺血(CLI),血管新生减少及侧枝循环形成障碍等因素引起的伤口愈合迟缓,不仅是糖尿病足发生的危险因素之一,还是导致糖尿病足患者截肢的独立危险因素之一,更重要的是PAD可增加患者心血管事件发生风险和病死率,PAD患者在确诊1年后心血管事件发生率高达21.14%,与已发生心脑血管病变者再次发作风险相当。因此,PAD具有发病率高、危害大、可防治难的特征,找寻新的有效的治疗外周血管病变(PAD)方法是临床上有效降低其致残率、致死率的关键。
亚硝基谷胱甘肽还原酶(S-nitrosoglutathionereductase, GSNOR)作为醇脱氢酶家族中一个特殊的蛋白酶,其在细胞内的主要作用是调节亚硝基谷胱甘肽(S-nitrosoglutathione, GSNO)的代谢,进而影响着细胞内一氧化氮(Nitric oxide, NO)的稳态调节。亚硝基谷胱甘肽还原酶(GSNOR)抑制剂N6022是一种特异的可逆的亚硝基谷胱甘肽还原酶抑制剂,研究表明N6022能够有效改善哮喘及过敏性气道炎症,并且N6022作为治疗慢性哮喘和囊性纤维病的一期、二期临床实验已经完成。近期有文献报道,N6022对治疗自身免疫性脑脊髓炎(EAE)也有一定疗效。但是N6022是否能够改善糖尿病外周动脉疾病(PAD)及其机制目前尚未有任何相关的研究和报道。
发明内容
解决的技术问题:本发明提供一种N6022在治疗糖尿病外周动脉疾病中的医药用途,通过抑制GSNOR的活性,从而有效改善糖尿病外周动脉疾病。该方法包含给糖尿病侧肢缺血模型小鼠尾静脉注射N6022,以及利用N6022抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中GSNOR的活性。
技术方案: GSNOR作为标志物在制备治疗糖尿病外周动脉疾病(PAD)药物试剂盒中的应用。
GSNOR作为标志物在筛选治疗糖尿病外周动脉疾病(PAD)药物中的应用。
抑制GSNOR表达的抑制剂N6022在制备治疗糖尿病外周动脉疾病(PAD)药物中的应用。
有益效果:给糖尿病侧肢缺血模型小鼠尾静脉注射N6022,可有效改善缺血侧肢的血流恢复,从而起到治疗糖尿病外周血管疾病(PAD)的效果;利用N6022抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)GSNOR的活性,可有效改善由高糖引起的内皮细胞迁移、成管能力的降低。
附图说明
图1为激光散斑血流成像系统监测侧肢的血流恢复情况图,其中a:通过构建糖尿病小鼠侧肢缺血模型,术后分别尾静脉注射对照溶剂DMSO,以及不同浓度的N6022(0.01mg/kg/day,0.1mg/kg/day,1mg/kg/day), 激光散斑血流成像系统监测右侧结扎侧肢的血流恢复情况;b:结扎侧肢血流灌注比统计(缺血侧肢/正常侧肢)。*与糖尿病小鼠注射对照溶剂DMSO的实验组相比*<0.05。
图2为对小鼠缺血侧肢的腓肠肌进行冰冻切片,免疫荧光(CD31)检测血管新生结果图,其中a:通过对小鼠腓肠肌冰冻切片,免疫荧光(CD31)检测血管新生情况;b:新生血管面积量化图。*与未造糖尿病模型注射对照溶剂DMSO的对照组相比*<0.05,#与糖尿病小鼠注射对照溶剂DMSO的实验组相比#<0.05。
图3为对小鼠缺血侧肢的半膜肌进行冰冻切片,免疫荧光(α-SMA)检测动脉生成结果图,其中a:通过对小鼠半膜肌冰冻切片,免疫荧光(α-SMA)检测动脉生成情况;b:新生小动脉面积量化图。*与未造糖尿病模型注射对照溶剂DMSO的对照组相比*<0.05,#与糖尿病小鼠注射对照溶剂DMSO的实验组相比#<0.05。
图4为分离造模小鼠的主动脉进行主动脉环出芽(Aortic ring assay)实验结果图,其中a:通过提取小鼠主动脉内皮,主动脉环出芽(Aortic ring assay)实验检测出芽能力;b:动脉出芽面积量化图。*与未造糖尿病模型注射对照溶剂DMSO的对照组相比*<0.05,#与糖尿病小鼠注射对照溶剂DMSO的实验组相比#<0.05。
图5为成管实验结果图,其中 a:通过对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)高糖(HG)处理24h,给予不同浓度(1nM、10nM、100nM)的N6022,甘露醇为高渗对照,检测HUVEC成管能力;b:成管面积量化图。*与未加高糖(HG)处理的对照组相比p<0.05,#与相同浓度高糖(HG)处理但未给予N6022的实验组相比#<0.05。
图6为划痕实验结果图,其中 a:通过对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)高糖(HG)处理,给予N6022(10nM),甘露醇为高渗对照,划痕实验检测HUVEC细胞的迁移能力;b:迁移面积量化图。*与未加高糖(HG)处理的对照组相比p<0.05,#与相同浓度高糖(HG)处理但未给予N6022的实验组相比#<0.05。
图7为Transwell实验结果图,其中a:通过对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)高糖(HG)处理,给予N6022(10nM),甘露醇为高渗对照,Transwell实验检测HUVEC细胞的迁移能力;b:细胞迁移量比率量化图。*与未加高糖(HG)处理的对照组相比p<0.05,#与相同浓度高糖(HG)处理但未给予N6022的实验组相比#<0.05。
图8为球体出芽(Spheroid capillary sprouting assay)实验结果图,其中 a:通过对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)高糖(HG)处理,给予N6022(10nM),甘露醇为高渗对照,球体出芽(Spheroid capillary sprouting assay)实验检测HUVEC细胞的迁移能力;b:出芽面积量化图。*与未加高糖(HG)处理的对照组相比p<0.05,#与相同浓度高糖(HG)处理但未给予N6022的实验组相比#<0.05。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容,但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换,均属于本发明的范围。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。以下实施例中所使用的试剂和材料均为市售产品。实例中所用N6022为市售产品,购买于selleck.cn。
实施例1:N6022对糖尿病侧肢缺血模型小鼠侧肢缺血情况的改善作用
为了探索N6022对糖尿病侧肢缺血模型小鼠侧肢缺血情况的影响,我们选用了SPF级8周雄性C57BL/6小鼠(购于南京医科大学医药实验动物中心),随机分为五组:溶剂对照组,糖尿病模型溶剂对照组及三个不同N6022浓度(0.01mg/kg/day、0.1mg/kg/day、1mg/kg/day)糖尿病模型给药组。其中糖尿病模型是在小鼠8周时,通过连续5天腹腔注射链脲霉素(STZ)60mg/kg/day,10周时测血糖>16.6 mmol/L,所有组别小鼠在11周造侧肢缺血模型,术后通过尾静脉注射不同浓度的N6022(0.01mg/kg/day、0.1mg/kg/day、1mg/kg/day)以及对照溶剂DMSO,分别在第0、7、14天通过激光散斑血流成像系统监测侧肢的血流恢复情况。并且分离小鼠缺血侧肢的腓肠肌进行冰冻切片,免疫荧光(CD31)检测血管新生情况;分离半膜肌进行冰冻切片,免疫荧光(α-SMA)检测动脉生成情况。同时我们分离了造模小鼠的主动脉进行主动脉环出芽(Aortic ring assay)实验检测出芽能力从而反映血管新生状况。
图1激光散斑血流成像系统监测侧肢的血流恢复情况结果表明,在糖尿病小鼠尾静脉注射不同浓度的N6022(0.01mg/kg/day、0.1mg/kg/day、1mg/kg/day)的第7天和第14天,缺血侧肢的血流灌注量均明显高于糖尿病小鼠,缺血情况得到改善。
图2对小鼠缺血侧肢的腓肠肌进行冰冻切片,免疫荧光(CD31)检测血管新生,结果显示,给药组(N6022 0.1mg/kg/day)血管新生情况较于糖尿病模型小鼠得到明显改善。
图3 对小鼠缺血侧肢的半膜肌进行冰冻切片,免疫荧光(α-SMA)检测动脉生成,结果显示,给药组(N6022 0.1mg/kg/day)动脉生成明显高于糖尿病模型小鼠。
图4分离造模小鼠的主动脉进行主动脉环出芽(Aortic ring assay)实验,结果显示,给药组(N6022 0.1mg/kg/day)小鼠的主动脉出芽能力明显高于糖尿病模型小鼠。
实施例2:N6022对由高糖引起的内皮细胞迁移、成管能力降低的改善作用
已知在糖尿病外周动脉疾病(PAD)中,血管新生减少是引起局部严重缺血继而发生溃疡、截肢的危险因素之一,为了研究GSNOR抑制剂N6022对高糖引起的内皮细胞功能受损的作用,所以我们在细胞水平通过成管实验检测血管生成能力,将HUVEC(2*10^4)种至凝好的Matrigel的24孔板中,通过给予不同浓度的N6022(1nM、10nM、100nM),甘露醇组为高糖的等渗对照,24h后检测血管生成情况。并且我们通过划痕实验、transwell实验、球体出芽(Spheroid capillary sprouting assay)实验检测内皮细胞的迁移能力,以上实验均说明N6022能明显逆转由高糖引起的内皮细胞迁移、成管能力的下降。
图5成管实验结果表明,在给予较低浓度的N6022(1nM、10nM、100nM)后,HUVEC细胞的成管能力较于单纯给予高糖刺激明显改善,其中给予10nM N6022处理细胞后,内皮细胞的成管能力恢复更显著。
图6划痕实验结果表明,高糖处理下,在给予N6022(10nM)后,HUVEC细胞的迁移能力得到改善。
图7Transwell实验结果表明,在给予N6022(10nM)后,HUVEC的细胞迁移量较于高糖组明显增加,细胞迁移能力得到恢复。
图8球体出芽(Spheroid capillary sprouting assay)实验结果表明,高糖刺激HUVEC细胞出芽能力明显降低,而在给予N6022(10nM)后细胞出芽能力增加,迁移能力改善。
机译: 取代的环己烷衍生物,其在制造医药产品和用于治疗II型糖尿病和其他疾病的医药产品中的用途
机译: 取代的环己烷衍生物,其在制造医药产品和用于治疗II型糖尿病和其他疾病的医药产品中的用途
机译: 衍生自取代的喹唑啉的化合物,酶抑制剂depteptidilpeptidasa IV(dpp-iv);制备盐化合物的方法;化合物;医药中间体组成;制备药物组合物的方法及其在治疗II型糖尿病或肥胖症中的用途。