SHH型髓母细胞瘤甲基化位点的应用

摘要

本发明涉及一种SHH型髓母细胞瘤甲基化位点的应用，属于肿瘤分型检测技术领域。具体为一种检测生物样本中ROBO4、OTX2OS1、AHRR、DKK4、PART1基因中至少一个基因位点甲基化程度的试剂在制备SHH型髓母细胞瘤诊断试剂或诊断设备中的应用。本发明人通过对大量SHH型髓母细胞瘤样本和其它型样本的数据进行分析和对比后发现，上述基因中的位点甲基化程度能够作为诊断SHH型髓母细胞瘤的参考指标，只需要定向检测几个甲基化位点，即可对髓母细胞瘤的SHH型进行分型和确认，从而降低了SHH型髓母细胞瘤的诊断难度并降低了成本。

说明书

技术领域

本发明涉及肿瘤分型检测技术领域，特别是涉及一种SHH型髓母细胞瘤甲基化位点的应用。

背景技术

髓母细胞瘤是儿童最常见的恶性脑肿瘤，大约有85％的髓母细胞瘤发生于18岁以下的儿童，而每5例患有脑肿瘤的儿童中，就有1例髓母细胞瘤。近年来，髓母细胞瘤患者的生存率有所改善，但其病死率仍然很高，即使是治疗成功的患者也常常发生神经、内分泌方面的后遗症。

髓母细胞瘤的发病率大约为0.71/10万人，在美国每年有400～500例的儿童患病，该病发病高峰在3～6岁，此病在50岁以后的人群中十分罕见。目前尚没有生化环境对髓母细胞瘤发病率有所影响的报道。但是，某些遗传疾病会导致髓母细胞瘤的发生，约有7％的患者生殖细胞基因会发生变异，也有少数髓母细胞瘤呈家族性遗传。

目前，国际上已经认识到髓母细胞瘤不是单一的疾病，而是多种不同分子亚型组成的脑肿瘤。各个亚型在遗传学、人口统计学和临床特点上均有显著差别。最近的主流观点认为，髓母细胞瘤只有4种核心的亚型：即WNT、SHH、Group3和Group4。不同亚型之间年龄分布也有显著的不同，SHH亚型在不同年龄段呈现典型的双高峰分布。SHH型好发于婴儿和成人，大约59％的成人髓母细胞瘤是SHH亚型，而绝大部分WNT亚型出现在儿童患者，Group3亚型常见于婴儿，而Groups亚型却多发于儿童和成人。

识别不同亚型不仅对理解髓母细胞瘤有很大的意义，而且还可为临床诊治提供帮助，比如：W1NT亚型往往接受标准治疗后预后较好；而对于SHH亚型的髓母细胞瘤，使用一些小分子的通路抑制剂对病情很有帮助。

然而，目前诊断SHH型髓母细胞瘤主要参考其基因表达图谱，需要RNA转录组测序，成本高，实验及分析周期长，因RNA容易降解，对实验操作的技术要求也较高，因此实验失败率和实验误差都相对较高。

发明内容

基于此，有必要针对上述问题，提供一种SHH型髓母细胞瘤甲基化位点的应用，将该SHH型髓母细胞瘤甲基化位点应用于检测试剂盒及系统中，采用该试剂盒及系统，只需要定向检测几个甲基化位点，即可对髓母细胞瘤的SHH型进行分型和确认，除检测成本不到转录组测序的1/10的优点外，还具有实验周期短，检测对象为DNA，实验成功率高的特点。

一种检测生物样本中ROBO4、OTX2OS1、AHRR、DKK4、PART1基因中至少一个基因位点甲基化程度的试剂在制备SHH型髓母细胞瘤诊断试剂或诊断设备中的应用。

本发明人通过对大量SHH型髓母细胞瘤样本和其它型髓母细胞瘤样本(包括髓母细胞瘤中的其它亚型：WNT、Group3和Group4)的数据进行分析和对比后发现，上述基因中的位点甲基化程度能够作为诊断SHH型髓母细胞瘤的参考指标，只需要定向检测几个甲基化位点，即可对髓母细胞瘤的SHH型进行分型和确认，从而降低了SHH型髓母细胞瘤的诊断难度并降低了成本。

上述生物样本可以为术后组织或其他方法获取的肿瘤组织样本。

可以理解的，上述产品可以是试剂盒，也可以是一体化检测设备。

本发明还公开了一种SHH型髓母细胞瘤的检测试剂盒，包括检测以下至少一个基因位点甲基化程度的试剂：ROBO4、OTX2OS1、AHRR、DKK4、PART1。

上述检测试剂盒可用于检测生物样本中ROBO4、OTX2OS1、AHRR、DKK4、PART1中至少一个基因位点的甲基化程度，从而辅助SHH型髓母细胞瘤诊断或进行用药指导。

可以理解的，上述检测方法可以采用甲基化芯片、甲基化特异性PCR、亚硫酸氢盐测序法等常规检测方法，或者其它能够检测出上述位点甲基化程度的方法均可。

在其中一个实施例中，所述ROBO4基因中的位点包括：cg20419291、cg09684429和cg19764370中的至少一个位点。

在其中一个实施例中，所述OTX2OS1基因中的位点包括：cg22967396、cg23974194、cg04548856、cg14248715和cg05732979中的至少一个位点。

在其中一个实施例中，所述AHRR基因中的位点包括：cg02385153、cg24064903、cg24980413和cg16336872中的至少一个位点。

在其中一个实施例中，所述DKK4基因中的位点包括：cg02571142和cg09297903中的至少一个位点。

在其中一个实施例中，所述PART1基因中的位点为cg26353176。

本发明还公开了一种SHH型髓母细胞瘤的检测系统，包括以下模块：

检测模块，采用上述的检测试剂盒检测相应的位点甲基化程度；

分析模块，获取上述检测结果，与预定的各位点甲基化程度判定值进行对比，得出SHH型髓母细胞瘤的检测结果；

上述检测系统，只需要定向检测几个甲基化位点，即可对髓母细胞瘤的SHH型进行分型和确认，从而降低了SHH型髓母细胞瘤的诊断难度并降低了成本。

在其中一个实施例中，所述甲基化程度为甲基化值b-value。b-value指位点的甲基化比例，以b-value作为甲基化程度的判断标准，具有简便、直观的效果。

在其中一个实施例中，所述分析模块中，若cg20419291的b-value大于0.520、cg09684429的b-value大于0.371、cg19764370的b-value大于0.641、cg22967396的b-value大于0.317、cg23974194的b-value大于0.387、cg04548856的b-value大于0.389、cg14248715的b-value大于0.619、cg05732979的b-value大于0.404、cg02385153的b-value大于0.594、cg24064903的b-value大于0.412、cg24980413的b-value大于0.754、cg16336872的b-value大于0.733、cg02571142的b-value大于0.430、cg09297903的b-value大于0.440、和/或cg26353176的b-value大于0.564，则提示为SHH型髓母细胞瘤。

本发明人经过大量样本的筛选和比对，最终得出区分SHH型与其他类型髓母细胞瘤的最优临界值，以该值为判断标准，能够为SHH型髓母细胞瘤的诊断提供依据。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明的一种SHH型髓母细胞瘤甲基化位点的应用，是发明人通过对大量SHH型髓母细胞瘤样本和其它样本的数据进行分析和对比后发现，采用该ROBO4、OTX2OS1、AHRR、DKK4、PART1基因中的位点甲基化程度能够作为诊断SHH型髓母细胞瘤的参考指标，只需要定向检测几个甲基化位点，即可对髓母细胞瘤的SHH型进行分型和确认，从而降低了SHH型髓母细胞瘤的诊断难度并降低了成本。

附图说明

图1为实施例2中cg26353176、cg16336872、cg23974194和cg22967396位点b-value值盒图；

图2为实施例2中cg02571142、cg09684429、cg02385153和cg05732979位点b-value值盒图；

图3为实施例2中cg14248715、cg20419291、cg04548856和cg24064903位点b-value值盒图；

图4为实施例2中cg19764370、cg09297903和cg24980413位点b-value值盒图；

图5为实施例2中cg26353176、cg16336872、cg23974194和cg22967396位点ROC曲线图；

图6为实施例2中cg02571142、cg09684429、cg02385153和cg05732979位点ROC曲线图；

图7为实施例2中cg14248715、cg20419291、cg04548856和cg24064903位点ROC曲线图；

图8为实施例2中cg19764370、cg09297903和cg24980413位点ROC曲线图；

图9为实施例2中ATP7B基因位点甲基化b-value值盒图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

实施例1

样本收集及检测。

一、样本收集。

收集SHH型髓母细胞瘤患者术后组织样本223例，以及除SHH外其他型髓母细胞瘤患者术后组织样本540例，即OTHERS样本(包括髓母细胞瘤中的其它亚型：WNT、Group3和Group4)。

二、样本检测。

以商品化的Illumina HumanMethylation450 BeadChip芯片检测甲基化，按照常规实验步骤进行，主要实验流程包括：

1、提取样本DNA并扩增；

2、使用酶打断DNA使之片段化；

3、分离纯化DNA片段并加上接头；

4、DNA片段与芯片杂交；

5、芯片上机检测。

实施例2

甲基化位点的筛选。

一、甲基化位点初筛。

以实施例1的数据作为数据库，先建立基于单个甲基化位点的模型，然后挑选高区分度的甲基化位点构建基于一系列甲基化位点的综合模型。再根据选定的甲基化位点(一个或多个)的b-value值构成一个样本的特征值向量，同时每个样本对应一个肿瘤分型(SHH型髓母细胞瘤或OTHERS)，由此建立一个SVM分类模型，进而得出显著性差异的甲基化位点，具体如下表所示。

表1.SHH型髓母细胞瘤和OTHERS具有显著性差异的甲基化位点

位点基因所在染色体位点染色体坐标正/负链cg20419291ROBO4chr11124767974+cg09684429ROBO4chr11124768015-cg19764370ROBO4chr11124767933+cg22967396OTX2OS1chr1457283942+cg23974194OTX2OS1chr1457284319-cg04548856OTX2OS1chr1457284528-cg14248715OTX2OS1chr1457284096-cg05732979OTX2OS1chr1457284219+cg02385153AHRRchr5404766+cg24064903AHRRchr5404910+cg24980413AHRRchr5346987-cg16336872AHRRchr5435267-cg02571142DKK4chr842234803-cg09297903DKK4chr842234798-cg26353176PART1chr559783906-

注：+表示正链，-表示负链。

二、甲基化位点验证。

1、b-value值对比。

统计上述位点在SHH型髓母细胞瘤和其它(OTHERS)患者中的b-value值，结果如下表和图1-4所示。

表2.SHH型髓母细胞瘤和OTHERS的b-value值对比

图1-4为不同位点b-value值盒图(boxplot)，图中方形盒子的中间横线所对应的b-value值表示平均值。

通过上述结果可以看出，以上位点在SHH型髓母细胞瘤中的甲基化程度高于其它类型，据此，可将上述位点的高甲基化程度作为SHH型髓母细胞瘤诊断的辅助指标。

2、roc-auc验证。

绘制受试者上述位点的ROC曲线(受试者工作特征曲线，receiver operatingcharacteristic curve，即ROC曲线)，结果如图5-所示，图中横坐标为假阳性率，纵坐标为真阳性率，AUC表示曲线下面积，该ROC曲线的AUC值越接近1，表示该指标有更高的诊断价值。

通过上述结果可以看出，cg26353176的ROC-AUC值为1.00、cg16336872的ROC-AUC值为1.00、cg23974194的ROC-AUC值为1.00、cg22967396的ROC-AUC值为0.99、cg02571142的ROC-AUC值为0.99、cg09684429的ROC-AUC值为1.00、cg02385153的ROC-AUC值为1.00、cg05732979的ROC-AUC值为0.99、cg14248715的ROC-AUC值为0.99、cg20419291的ROC-AUC值为1.00、cg04548856的ROC-AUC值为0.99、cg24064903的ROC-AUC值为1.00、cg19764370的ROC-AUC值为1.00、cg09297903的ROC-AUC值为1.00、cg24980413的ROC-AUC值为0.99，均在0.99以上，表示上述位点甲基化程度对SHH型髓母细胞瘤具有越高的识别能力。

3、SHH型髓母细胞瘤各位点b-value值分析。

3.1各位点b-value值分析。

对所得SHH型髓母细胞瘤各高区分度甲基化位点b-value值进行分析，结果如下表所示。

表3.SHH型髓母细胞瘤各位点b-value值

从上述结果中可以看出，SHH型髓母细胞瘤中b-value值集中度较高，SHH型和其他类型的区分较开，可以此作为一个辅助判断标准。

3.2各位点b-value临界值分析

根据所建立的模型计算出b-value临界值，如下表所示。

表4.b-value临界值

位点b-value临界值FPRTPRcg263531760.5640.0170.996cg163368720.7330.0300.991cg239741940.3870.0040.964cg229673960.3170.0090.955cg025711420.4300.0200.991cg096844290.3710.0200.996cg023851530.5940.0110.987cg057329790.4040.0060.955cg142487150.6190.0040.955cg204192910.5200.0130.996cg045488560.3890.0090.969cg240649030.4120.0070.987cg197643700.6410.0060.996cg092979030.4400.0280.991cg249804130.7540.0350.991

FPR：false positive rate，假阳性率；TPR：true positive rate，真阳性率。

上述b-value临界值作为分类边界时的FPR和TPR如上表所示，该临界值的选取使FPR和TPR达到最优平衡，即ROC曲线上凸包处切线的切点，以该值为判断标准，能够为SHH型髓母细胞瘤的诊断提供较好的依据。

4、对照验证。

随机选取ATP7B基因，检测并分析其中部分位点的甲基化水平，结果如图9所示，图9为ATP7B基因在SHH型髓母细胞瘤和OTHERS组中的各位点甲基化b-value值的盒图，结果表示两组样本间甲基化几乎无差异。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。