一株副氧化微杆菌及其广谱多氯联苯酶制剂的制备方法与应用

摘要

本发明涉及一株副氧化微杆菌及其广谱多氯联苯酶制剂的制备方法与应用。副氧化微杆菌(Microbacterium paraoxydans)ECO‑2，2018年06月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号CGMCC No.15836。副氧化微杆菌ECO‑2菌株通过联苯单一底物诱导培养后获得的胞内复合酶在好样条件下可以降解PCB28、PCB101和/或PCB114等低氯和高氯代PCBs，酶制剂降解谱系广，与现有已知的单一诱导培养只能降解单一成分具有明显差别，具有广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一株副氧化微杆菌及其广谱多氯联苯酶制剂的制备方法与应用，属于微生物技术领域。

背景技术

持久性有机污染物多氯联苯(PCBs)具有高毒性、生物蓄积性和长距离迁移性，半衰期长，严重污染土壤、水生生态系统和饮用水源，致畸致癌。由PCBs污染导致的台湾油症事件及日本米糠油事件均造成惨重的生命财产损失。PCBs因热和化学稳定性、阻燃性、绝缘性及抗氧化性，广泛应用于化工、电力、电子和机械行业，目前我国PCBs及其污染物现存量大，电子垃圾及工业场地搬迁存在大量PCBs污染场地。2015年，环保部发布国家环境保护标准(HJ743-2015)《土壤和沉积物多氯联苯的测定气相色谱-质谱法》，规范土壤和沉积物中PCBs的测定方法。及时有效地治理PCBs污染，保护环境，保障人体健康已迫在眉睫。PCBs异构体具有多样性，共平面结构的PCBs具有与二噁英相似的毒性，指示性PCBs 为联合国GEMS/FOOD中规定作为PCBs污染状况监测的指示性单体，环境中的PCBs主要污染物三氯联苯PCB28、五氯联苯PCB101均为其代表性化合物。

多氯联苯(PCBs)因具有热和化学稳定性、阻燃性、绝缘性及抗氧化性，广泛应用于化工、电力、电子和机械行业，用途主要包括绝缘油、阻燃剂、导热剂、液压油、增塑剂；铁路变压器、矿井设备、电磁设备、无碳复写纸、颜料；蜡添加物、除尘剂、杀虫剂添加物、滑润剂、切削油、密封剂和堵漏剂。我国历年累计产量近万吨，虽然80年代初国内基本停产，但因曾由一些发达国家进口含有PCBs的电力电容器、动力变压器，同时90年代后国外主要通过电子垃圾向我国输入，目前我国PCBs及其污染物现存量仍然很大，工业场地搬迁存在大量的PCBs污染场地。PCBs通过废物排放、储油罐泄露、挥发和干、湿沉降等原因进入土壤及水环境，对土壤、水生生态系统和饮用水源产生严重污染，再加上对PCBs的管理力度不够、处置与保管不当，PCBs的二次污染和永久性污染问题相当严重。

中国专利文献CN107287134A(申请号201710508652.X)公开了一株假单胞菌(Pseudomonas sp.)ECO-1菌株，2017年3月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.13960。本发明首次从POPs污染土壤中分离获得一株假单胞菌(Pseudomonas sp.)ECO-1菌株，利用该菌株首次制备获得能够高效降解多氯联苯、阿特拉津的双功能酶制剂，尤其对在好氧条件下难降解的高氯代多氯联苯降解活性显著，这与现有已知的假单胞菌(Pseudomonas sp.)及其酶制剂的功能完全不同，具有大规模生产应用前景。

但上述菌株的处理速度及处理多氯联苯的种类仍然无法满足实际处理的需要，在好氧条件下实现对PCBs复合污染的快速修复，成为目前的研究热点。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一株副氧化微杆菌及其广谱多氯联苯酶制剂的制备方法与应用。

本发明技术方案如下：

一株副氧化微杆菌(Microbacterium paraoxydans)ECO-2，2018年06月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号CGMCC No.15836。

该菌株纯培养单克隆形态如图1所示，菌落呈黄色，且边缘和表面光滑，圆形。

上述菌株的培养方法，步骤如下：

(1)取副氧化微杆菌(Microbacterium paraoxydans)ECO-2菌株划线于固体活化培养基上，活化培养，制得活化后菌株；

(2)取步骤(1)制得的活化后菌株接种至液体培养基中，摇床培养，制得种子液；

(3)取步骤(2)制得的种子液，按体积百分比2％～10％转接至扩大培养基中，扩大培养，制得菌液。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，固体活化培养基为LB固体培养基，组份如下：

蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂20g，水定容至1L，pH自然。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，活化条件为：28～37℃倒置培养1～2天。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中的液体培养基与步骤(3)中的扩大培养基均为LB 液体培养基，组份如下：

蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，水定容至1L，pH自然。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中的摇床培养条件为：28～37℃转速为100～200转 /分钟的条件下，摇床培养1～2天。

根据本发明优选的，所述步骤(3)中的扩大培养条件为：28～37℃、溶氧20～70％的条件下，扩大培养1～2天。

上述副氧化微杆菌(Microbacterium paraoxydans)ECO-2在制备修复多氯联苯污染土壤酶制剂中的应用。

上述应用，步骤如下：

(i)取副氧化微杆菌(Microbacterium paraoxydans)ECO-2的菌液，按1～10％的体积百分比接种于无机盐诱导培养基中，在温度为28～37℃、转速为100～200转/分钟的条件下，诱导培养3～5天，制得诱导后副氧化微杆菌(Microbacterium paraoxydans)ECO-2菌液；

所述无机盐诱导培养基为含有浓度0.3～0.8g/L联苯的无机盐培养基；

(ii)取步骤(i)制得的诱导后副氧化微杆菌(Microbacterium paraoxydans)ECO-2菌液，固液分离，取菌体，悬浮于磷酸缓冲液，经细胞破碎，4～25℃条件下固液分离，取上清，制得酶制剂。

根据本发明优选的，所述步骤(i)中，无机盐培养基每升组份如下：

磷酸二氢钾0.5g，磷酸氢二钠0.5g，硫酸镁0.2g，氯化钙0.1g，氯化钠0.2g，硫酸铵1.0g，蛋白胨2.0g，pH7.0。

根据本发明优选的，所述步骤(ii)中，固液分离为在3000～10000转/分钟的条件下，离心2～10分钟。

根据本发明优选的，所述步骤(ii)中，细胞破碎采用高压均质细胞破碎。

根据本发明优选的，所述步骤(ii)中，磷酸缓冲液为pH5.0～8.0的磷酸缓冲液；优选的，磷酸缓冲液用量为5～50倍体积。

上述酶制剂在修复多氯联苯污染土壤中的应用。

根据本发明优选的，所述多氯联苯为2,4,4’-三氯联苯(PCB28)、2,2’,4,5,5’-五氯联苯 (PCB101)和/或2,3,4,4’,5-五氯联苯(PCB114)。

有益效果

1、本发明首次公开了副氧化微杆菌(Microbacterium paraoxydans)ECO-2菌株，通过联苯单一底物诱导培养后获得的胞内复合酶在好氧条件下可以降解PCB28、PCB101和/或 PCB114等低氯和高氯代PCBs，酶制剂降解谱系广，与现有已知的单一诱导培养只能降解单一成分具有明显差别，与物化处理方法相比更具环保性且便于大规模操作，与微生物方法相比，降解速率快，缩短修复周期，提高降解效率，具有广阔的应用前景；

2、利用副氧化微杆菌(Microbacterium paraoxydans)ECO-2制备获得的广谱多氯联苯酶制剂，对于共平面结构的PCB114、以及环境污染指示性三氯联苯PCB28、五氯联苯PCB101 均有高效降解活性，对五氯联苯PCB101降解率可达100％，适用范围更广，且在制备过程中无需加入毒性更高的高氯代PCBs进行诱导，制备工艺简单，具有大规模生产应用潜力。

附图说明

图1为副氧化微杆菌(Microbacterium paraoxydans)ECO-2菌株纯培养单克隆形态照片；

具体实时方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

生物来源

副氧化微杆菌(Microbacterium paraoxydans)ECO-2，2018年06月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号CGMCC No.15836。

培养基

LB固体培养基，每升组分如下：

蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂20g，水定容至1L，pH自然；

LB液体培养基，每升组分如下：

蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，水定容至1L，pH自然；

无机盐培养基，每升组分如下：

磷酸二氢钾0.5g，磷酸氢二钠0.5g，硫酸镁0.2g，氯化钙0.1g，氯化钠0.2g，硫酸铵1.0g，蛋白胨2.0g，水定容至1L，pH7.0；

实施例1

取POPs污染土壤浸出液，分别稀释至浓度为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5的5个浓度梯度。将稀释后的菌悬液涂布于含有联苯的固体培养基，30℃培养1～3天。将生长快、形态典型的细菌菌落挑出，然后经过3次平板划线分离纯化后，挑单菌落于无机盐液体培养基中，30℃、150转/分钟培养3天，取培养物1.5mL加入0.5mL甘油，混匀后于-80℃冰箱长期保存。

用于涂布菌悬液的固体培养基为LB固体培养基，组分如下：

蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂20g，水定容至1L，pH自然。

用于单菌落培养的无机盐液体培养基组分如下：

磷酸二氢钾0.5g，磷酸氢二钠0.5g，硫酸镁0.2g，氯化钙0.1g，氯化钠0.2g，硫酸铵1.0g，蛋白胨2.0g，水定容至1L，pH7.0。

将上述所得到的菌株，分别接种到含有浓度25mg/L的多氯联苯PCB28(2,4,4’-三氯联苯)、PCB101(2,2’,4,5,5’-五氯联苯)、PCB114(2,3,4,4’,5-五氯联苯)的无机盐液体培养基上， 150转/分钟、30℃培养72h，观察菌液浑浊情况，同时取菌悬液进行600nm处的吸光值检测。依据上述指标选择产酶菌株。将在吸光值最高的菌株挑取到LB固体培养基上培养，并保种记为ECO-2。

取单克隆送青岛擎科梓熙生物技术有限公司进行测序，经检测，16S rDNA序列含有 1357bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，经菌种鉴定，属于Microbacteriumparaoxydans，命名为副氧化微杆菌(Microbacterium paraoxydans)ECO-2，2018年06月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏号CGMCC No.15836。

菌种鉴定过程如下：

样品：细菌菌液；

细菌基因组DNA提取试剂盒：天根生化科技(北京)有限公司，DP302；

TAE缓冲液(50×，1L)：Tris 242g、冰醋酸57.1ml、Na2EDTA.2H2O 37.2g、加水至1L；

琼脂糖：BIOWET，AGAROSE G-10；

2×Pfu PCR MasterMix、D2000DNA Marker、核酸染料，loading buffer等：天根生化科技(北京)有限公司

DNA纯化回收试剂盒：天根生化科技(北京)有限公司，DP214

离心管、枪头等耗材：美国Gene Era Biotech公司(GEB)

引物：由青岛擎科梓熙生物技术有限公司合成，按照合成单加入ddH₂O，制成10μM溶液。

1、基因组DNA提取，按DP302试剂盒操作。

2、PCR扩增

2.1通用引物信息

2.2PCR扩增体系组分及构成

2.3PCR循环参数

预变性：94℃，3min；变性94℃，30s，退火55，30s，延伸，72℃，1.5min(共35个循环)；延伸72℃，10min；4℃保存。

3、琼脂糖凝胶电泳检测

制备1.0％的琼脂糖凝胶，电泳时电压设置为18V/cm，电泳时间为20min。

4、纯化回收

使用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对目的片段进行琼脂糖凝胶回收，回收产物由青岛擎科梓熙生物技术有限公司测序。

测序拼接序列及blast比对：

Accession 1比对1IdentKY425786.1Microbacterium paraoxydans strain MA25 16S ribosomal RNA gene,partial sequence100％

实施例2

利用实施例1所述的副氧化微杆菌(Microbacterium paraoxydans)ECO-2制备广谱多氯联苯降解酶制剂的方法，步骤如下：

(1)取副氧化微杆菌(Microbacterium paraoxydans)ECO-2划线于LB固体培养基上，35℃倒置活化培养2天，制得活化后菌株；

(2)取步骤(1)制得的活化后菌株接种至LB液体培养基中，35℃转速为200转/分钟的条件下，摇床培养2天，制得种子液；

(3)取步骤(2)制得的种子液，按体积百分比10％转接至含联苯0.5g/L的无机盐培养基中，35℃、溶氧70％的条件下，扩大培养2天，制得菌液；

(4)取步骤(3)制得的菌液，在3000转/分钟的条件下，离心10分钟，收集菌体，悬浮于30倍体积的pH7.0的磷酸缓冲液中，经高压均质细胞破碎，然后在4℃、3000转/分钟的条件下，离心2分钟，收集上清液，制得广谱多氯联苯降解酶制剂。

对比例1

遗传关系最接近的副氧化微杆菌Microbacterium paraoxydans strain MA25按照实施例2 的方法制备酶制剂，在步骤(3)的无机盐培养基中培养，未观察到菌液浑浊，同时取菌悬液进行600nm处的吸光值检测，OD_600nm值为零，表明副氧化微杆菌Microbacteriumparaoxydans>

对比例2

菌株(Pseudomonas sp.)ECO-1按照实施例2的方法制备酶制剂。在步骤(3)的无机盐培养基中培养，观察到菌液浑浊，同时取菌悬液进行600nm处的吸光值检测，OD_600nm值为1.05，表明假单胞菌(Pseudomonas>

实验例

将浓度25mg/L的五氯联苯PCB114、PCB101、三氯联苯PCB28各自与广谱多氯联苯酶制剂和PBS缓冲液按1:5:19(体积比)的比例混合后，在30℃、pH7.0下分别反应10h、 13h、10h，加入10mL正己烷萃取3次，取萃取液，用GC-MS法检测上述多氯联苯降解率。

经检测发现，实施例2获得的广谱多氯联苯降解酶制剂在好氧条件下，对三氯联苯PCB28 的降解率在10h内可达90％，对类二噁英五氯联苯PCB114的降解率在10h内可达57.1％，对指示性五氯联苯PCB101的降解率在13h内可达100％。

对比例2中，仅对类二噁英五氯联苯PCB114的降解率在10h内可达60.3％，其他几种的降解率为零。

由以上数据可以看出，本发明所述的副氧化微杆菌(Microbacteriumparaoxydans)ECO-2 经单一底物诱导后，就可以产生针对PCB114、PCB101、PCB28广谱多氯联苯酶制剂，较现有已知的单一底物诱导仅能产生单一降解酶制剂具有显著的应用价值。