一种基于顶端分生组织转分化的林木芽再生方法

摘要

本发明公开了一种基于顶端分生组织转分化的林木芽再生方法，包括以下步骤：(1)取林木组培苗的根为外植体，将外植体在含有生长素NAA的B5培养基中培养20‑26h；(2)将步骤(1)培养后的外植体转入含有细胞分裂素2‑IP的B5培养基中培养10‑14天；(3)将步骤(2)培养后的外植体转入含有细胞分裂素6‑BA的MS培养基中培养14‑18天，获得再生芽。本发明的林木芽再生方法不经过愈伤组织阶段直接形成茎端分生组织，从而产生再生芽，因此适用于建立研究植物细胞命运决定、谱系转变等科学问题的实验体系，适用于难以形成具有再生能力愈伤组织的物种建立芽再生体系，进而进行离体快繁、遗传转化或其他生物技术操作。

说明书

技术领域

本发明涉及植物再生技术领域，具体涉及一种基于顶端分生组织转分化的林木芽再生方法。

背景技术

被子植物的茎端分生组织位于茎的顶端，呈突起的穹顶结构，其细胞分裂和分化活动形成了整个地上部分。根据其内部细胞的结构特征可以将茎端分生组织分为三个不同的区域，即中心区域、周围区域和肋状区域(Meyerowitz,Cell,1997,88,299-308)。中心区域处在穹顶顶端的中心位置，包含一团分裂较慢的多能干细胞。干细胞分裂产生的子代细胞一方面进入四周毗邻的周围区域，参与包括花、叶在内的侧生器官的分化；另一方向下进入肋状区域，分化成茎的组成部分(Soyars et al.,Curr Opin Plant Biol 2016,29,163-168)。干细胞下方有一团被称为组织中心的细胞，发挥了调控干细胞维持的作用。茎端分生组织受到严密而精确的分子遗传调控，关键基因的时空特异性表达、细胞分裂与分化的动态平衡共同维持其特定的结构和功能(Aichinger et al.,Annu Rev Plant Biol,2012,63,615-636)。

在离体培养条件下，成熟的组织器官能够重新形成茎端分生组织，进而再生芽并产生新的植物个体(Sang et al.,New Phytol,2018,218,1334-1339)。在这一过程中，生长素和细胞分裂素发挥了至关重要的调控作用。最近的研究发现，芽再生过程中外植体中的中柱鞘和类中柱鞘细胞受到外源生长素诱导，形成具有根端分生组织细胞性质的愈伤组织。发明人前期的工作表明，转入分化培养阶段后，愈伤组织特定区域内生长素和细胞分裂素响应信号形成特定分布模式，细胞分裂素响应信号位于中心区域，而生长素在其周围呈环状分布(Cheng et al.,Plant Physiol,2013,161,240-251)。处在中心区域的细胞分裂素通过其信号转导途径中的B类Arabidopsis Response Regulator蛋白直接激活茎端干细胞特征决定基因WUSCHEL的表达，同时抑制生长素在该区域的积累，从而推动愈伤组织细胞发生命运转化，形成茎端分生组织(Meng et al.,Plant Cell,2017,29,1357-1372)。

芽再生是植物离体快繁和基因工程操作的先决条件，是作物林果花卉标准化生产的重要途径，对于发展智能农业和生物育种具有十分重要的意义(Sang et al.,TrendsPlant Sci,2018 23,660-666)。以杨树为代表的林木多为异花授粉，遗传背景高度杂合，不利于保持亲本优良性状。因此，基于器官再生的组织培养对于林木的繁殖和高产优质栽培体系的建立尤为重要。但是，多数具有重要经济价值的林木由于难以形成愈伤组织或愈伤组织不能进一步分化，无法建立芽再生体系，严重制约了生物技术在农林业中的应用发展。

发明内容

针对上述现有技术的情况，本发明的目的是提供一种基于顶端分生组织转分化的林木芽再生方法。本发明的林木芽再生方法是由侧根原基中的根端分生组织直接转分化形成茎端分生组织，不经过愈伤组织诱导和培养阶段，适用于建立研究植物细胞命运决定、谱系转变等科学问题的实验体系；适用于难以形成具有再生能力愈伤组织的物种建立芽再生体系，进而进行离体快繁、遗传转化或其他生物技术操作。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种基于顶端分生组织转分化的林木芽再生方法，包括以下步骤：

(1)取林木组培苗的根为外植体，将外植体在含有生长素NAA的B5培养基中培养20-26h；

(2)将步骤(1)培养后的外植体转入含有细胞分裂素2-IP的B5培养基中培养10-14天；

(3)将步骤(2)培养后的外植体转入含有细胞分裂素6-BA的MS培养基中培养14-18天，获得再生芽。

优选的，步骤(1)中，取林木组培苗的根，从根的近端起截取长度为2-4cm的根段作为外植体；更优选的，从根的近端起截取长度为2cm的根段作为外植体。

优选的，步骤(1)中，所述林木组培苗由如下方法制备而成：

1)选取林木枝条及叶片，依次用体积分数为75％的乙醇溶液、无菌水、氧化汞溶液和无菌水浸泡处理；

2)吸干步骤1)处理后的林木枝条及叶片表面的水，移入分化培养基中，置于25℃光照培养箱中进行培养；

3)培养至转化芽长度为2-3cm时，切下再生芽并移入生根培养基中，在光照周期为光照16h/黑暗8h、25℃条件下进行生根培养，获得组培苗。

更优选的，步骤2)中，所述分化培养基为含有0.002mg/L TDZ、0.5mg/L 6-BA和0.1mg/L NAA的MS培养基。

更优选的，步骤3)中，所述生根培养基为含有0.1mg/L IBA、0.01mg/L NAA的MS培养基。

优选的，步骤(1)中，所述B5培养基中，生长素NAA的浓度为2-14μM；更优选的，生长素NAA的浓度为10μM。

优选的，步骤(2)中，所述B5培养基中，细胞分裂素2-IP的浓度为2.8-10.8μM；更优选的，细胞分裂素2-IP的浓度为8.8μM。

优选的，步骤(3)中，所述MS培养基中，细胞分裂素6-BA的浓度为0.1-1.0mg/L；更优选的，细胞分裂素6-BA的浓度为0.5mg/L。

本发明的第二方面，提供上述林木芽再生方法在如下a)-d)至少一项中的应用；

a)难以形成具有再生能力愈伤组织的林木的离体繁殖；

b)高产优质林木栽培体系的建立；

c)林木优良品系的种质保存；

d)用于研究植物细胞命运决定、谱系转变的实验体系的建立。

本发明的第三方面，提供一种林木再生植株的获得方法，包括以下步骤：

利用上述林木芽再生方法获得芽，再将芽进行壮苗培养、生根培养、炼苗和移栽，即获得林木再生植株。

本发明的有益效果：

本发明的林木芽再生方法是以林木组培苗的根为外植体，先利用外源生长素促进根原基的形成，再利用外源细胞分裂素诱导根原基通过转分化形成茎端分生组织，从而产生再生芽。本发明提供的芽再生方法不需要经过愈伤组织诱导和培养阶段，适用于难以形成具有再生能力愈伤组织的物种建立芽再生体系，进而进行离体快繁、遗传转化或其他生物技术操作；该方法基于两种顶端分生组织的转分化，由根端分生组织转化为茎端分生组织，因此适用于建立研究植物细胞命运决定、谱系转变等科学问题的实验体系。

附图说明

图1：杨树基于转分化的芽再生培养过程；图中，D代表培养开始后的天数；84K为白杨品种，欧美杨107为黑杨品种。

图2：侧根原基形成和顶端分生组织转分化过程图；图中，Root explant表示根外植体，LR1-6表示根原基发育过程，Converting表示根端分生组织向茎端分生组织转变时期，SAM primordium表示茎端分生组织原基，SAM表示茎端分生组织。

图3：不同位置的根端作为外植体进行芽再生培养的表型比较图；图中，D代表培养开始后的天数，Proximal表示近端，Distal表示远端。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分所介绍的，现行的常规植物芽再生方法需要由外植体诱导愈伤组织的形成，再由愈伤组织中诱导芽的再生。但是，多数具有重要经济价值的林木由于难以形成愈伤组织或愈伤组织不能进一步分化，无法建立芽再生体系。也有报道模式植物拟南芥可以不经过愈伤组织诱导的过程，直接由根原基转分化形成再生芽。但是，多年生林木和一年生草本植物拟南芥在形态结构和生长发育调控机理上存在众多差异。林木由于植物生长周期长，次生代谢物分泌较多，在林木芽再生的过程中，直接诱导生成再生芽十分的困难。基于转分化的林木芽再生方法尚未见有报道，属于技术上的难点和空白点。

针对上述现有技术的情况，本发明结合长期的研究和探索，提供了一种基于顶端分生组织转分化的林木芽再生方法。该方法以林木组培苗的根为外植体，首先在只含有生长素的培养基中短暂培养，诱导侧根原基的发生；然后依次用两种只含有细胞分裂素的培养基进行培养，推动侧根原基中根端分生组织发生转分化，不经过愈伤组织阶段直接形成茎端分生组织，从而产生再生芽。

在本发明的一种实施方案中，给出的林木芽再生方法具体如下：

(1)取杨树组培苗的根为外植体，在含有生长素NAA(1-naphthylacetic acid，萘乙酸)的B5培养基中培养24小时，促进侧根原基的形成；

(2)将步骤(1)培养后的外植体转入含有细胞分裂素2-IP(N6–(2-isopentenyl)-adenosine，异戊烯基腺嘌呤)的B5培养基中培养12天；

(3)将步骤(2)培养后的外植体转入含有细胞分裂素6-BA(6-Benzylaminopurine，6-苄氨基嘌呤)的MS培养基中培养16天，获得再生芽(图1)。

利用微分干涉差显微镜观察发现，外植体中形成了侧根原基(图2，A-E)，并逐渐经历了膨大(图2，F-G)和转变(图2，H)过程，通过转分化形成了茎端分生组织(图2，I-J)。

上述林木芽的再生方法中，外植体的选择、植物激素的种类选择和处理浓度会直接林木芽的再生效果。其中：

外植体的选择是离体培养的首要步骤之一，可供选择的外植体有很多，木本植物的根、茎、叶都可以选作外植体。选择不同的外植体，其再生能力会存在显著的差异；即使选择木本植物的同一器官作为外植体，若选择的器官部位不同，也会影响外植体的再生能力。在根、茎、叶等不同器官中，本发明优选林木组培苗的根作为外植体，相较于茎和叶，其再生能力更强。进一步的，本发明还将杨树组培苗的根从远端到近端的方向按照2厘米左右的长度等分成A、B、C、D4段，分别作为外植体并利用上述方法进行培养。结果发现，根段D(即最靠近根近端)作为外植体时，芽再生效果最优(图3)。

不同植物激素的诱导效应各异，例如生长素可诱导细胞壁软化而促进细胞生长，细胞分裂素则可通过调控细胞周期因子而促进细胞分裂。植物激素对于细胞的调控具有“钟形”效应，即细胞对激素的应答具有最适浓度范围，激素浓度过低或过高均会使诱导作用受到抑制。植物中不同激素信号通路之间具有密切联系，细胞可以接受不同种类和强度的激素信号，并利用复杂的信号转导网络将其整合，最终表现为特定的细胞反应，即细胞的分化过程。本发明通过对植物激素种类、浓度以及处理顺序的优化选择，最终实现了难以形成愈伤组织的林木芽的直接再生。

采用本发明的方法可以显著缩短林木再生芽的培养周期，在30天内即可获得林木再生芽，林木再生芽的再生率达100％。在本发明的方法基础上，改变外植体的种类，或者改变外源植物激素的种类及浓度、调整外源植物激素的处理顺序，都会降低林木再生芽的再生率，并且延长了林木再生芽的培养周期。

本发明提供的芽再生方法由侧根原基中的根端分生组织直接转分化形成茎端分生组织，不需要经过愈伤组织诱导和培养阶段，因此适用于建立研究植物细胞命运决定、谱系转变等科学问题的实验体系，适用于难以形成具有再生能力愈伤组织的物种建立芽再生体系，进而进行离体快繁、遗传转化或其他生物技术操作。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。

实施例1：外植体的获得

(1)选取大田生长的健康杨树枝条及叶片，在超净工作台中置于75％的乙醇溶液中，浸泡2-3分钟，期间持续轻微摇动；

(2)再次用75％的乙醇溶液浸泡2-3分钟，期间持续轻微摇动；

(3)将枝条及叶片材料放入无菌水中浸泡1-2分钟，期间持续轻微摇动；

(4)将枝条及叶片材料转入1％氧化汞溶液中浸泡2-5分钟，期间持续轻微摇动；

(5)将枝条及叶片材料依次放到两瓶新的无菌水中，每瓶1-2分钟，

(6)重复步骤(4)和步骤(5)；

(7)用灭过菌的滤纸吸干材料表面的水，移入分化培养基(MS+0.002mg/L噻苯隆(TDZ)+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA)，置于25℃光照培养箱培养培养(光照周期16h光照/8h黑暗)；

(8)2个月后，转化芽长度达2cm左右时，切下并移入生根培养基(MS+0.1mg/LIBA+0.01mg/L NAA)中生根培养，光照周期16h光照/8h黑暗，25℃条件下培养；获得组培苗；

(9)在超净工作台中取出组培苗，用无菌水洗净根部附着的培养基并用无菌滤纸吸去表面水分，用刀片从根的近端起截取长度为2-4cm的根段作为外植体。

实施例2：基于转分化的芽再生培养

(1)将外植体(实施例1制备)置于含有10μM NAA的B5培养基中，置于25℃，16小时光照/8小时黑暗条件下培养24小时；

(2)将步骤(1)培养后的外植体转移到含有8.8μM 2-IP的B5培养基中，置于25℃，16小时光照/8小时黑暗条件下培养12天，其间每6天更换一次培养基；

(3)将步骤(2)培养后的外植体转移到含有0.5mg/L 6-BA的MS培养基中，置于25℃，16小时光照/8小时黑暗条件下培养16天，其间每6天更换一次培养基。

本实施例中，获得杨树再生芽的时间为29天，杨树再生芽的再生率为100％。

实施例3：顶端分生组织转分化过程的微分干涉相差显微镜观察

(1)取不同培养时间的外植体，用刀片切为0.5厘米左右的小段，置于1.5ml离心管中；

(2)加入1ml透明剂(8g水合氯醛，1ml甘油，3ml无菌水)，加入离心管；

(3)将离心管置于真空泵抽真空两次，每次10分钟；

(4)室温放置2-5天，具体时间根据材料透明效果判断；

(5)利用Zeiss Axio Scope A1荧光显微镜，采用DIC效果，通过1X目镜、10X物镜观察照相；图像先经LAS AF Lite处理，输出为JPEG图像。

结果见图2，由图2可以看出，外植体中形成了侧根原基(图2，A-E)，并逐渐经历了膨大(图2，F-G)和转变(图2，H)过程，通过转分化形成了茎端分生组织(图2，I-J)。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。