一种O型口蹄疫病毒突变株及其制备方法和应用

摘要

本发明提供了一种O型口蹄疫病毒突变株及其制备方法和应用，属于疫苗候选株技术领域。O型口蹄疫病毒突变株以rHN病毒株作为母本病毒株，将VP3蛋白的G–H环中以下氨基酸发生突变：第173位天冬氨酸突变为天冬酰胺，第174位缬氨酸突变为谷氨酸和第179位天冬酰胺突变为半胱氨酸。所述病毒突变株具有遗传稳定性且获得了小窝蛋白介导侵染CHO‑K1细胞的能力。通过检测免疫阳性血清的交叉中和能力，结果表明病毒突变株与母本病毒株相比，其诱导机体产生的口蹄疫病毒中和抗体的交叉保护能力有显著提升，表现出优异的抗原广谱性。所述病毒突变株经灭活制备的疫苗应可用于预防O型口蹄疫病毒的感染。

说明书

技术领域

本发明属于疫苗候选株技术领域，具体涉及一种O型口蹄疫病毒突变株及其制备方法和应用。

背景技术

口蹄疫(foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouthdisease virus，FMDV)引起猪、牛、羊等主要家畜和其它家养、野生偶蹄动物共患的一种急性、热性、高度接触性和可快速远距离传播的烈性传染病。该病是世界动物卫生组织(office international desépizooties，OIE)法定报告的动物传染病之一，我国也将其列在一类动物疫病病种名录之首[农业部公告第1125号，2008]。自1546年第一次有较为确切的口蹄疫文字记载以来，该病现仍在世界范围内长期广泛流行，危害巨大。尽管口蹄疫对成年易感动物的致死率不高(<5％)，但该病传染性极强，发病率可高达100％，由于患畜的生产性能下降，动物性产品进出口国际贸易受限，会造成惨重的直接经济损失和间接经济损失，且后者往往是前者的数十倍乃至百倍(Rowlands DJ.Foot-and-Mouth Disease.2003)。譬如，2001年，英国因口蹄疫疫情导致的经济损失超80亿英镑，甚至当年的议会大选都因此推迟了时间(Knowles NJ,et al.Outbreak of Foot-and-Mouth Disease Virus SerotypeO in the UK Caused by a Pandemic Strain.Vet Rec.2001,148:258–259)。故该病不仅严重威胁农牧业乃至整个国民经济的持续健康发展，而且会造成严重的社会负面影响，素有“政治经济病”之称。

我国是养殖业大国，也是口蹄疫危害较为严重的国家之一。根据农业部统计数据，推算产业链年损失上千亿元，防控形势严峻(浦华.动物疾病防控的经济学研究综述.农业经济问题.2006,6:61–64)。在国际贸易往来日益频繁的今天，我国口蹄疫的防控、净化与根除不仅对发展农业经济，保障食品安全、卫生与健康和维护国家声誉起关键作用，而且对推动全球口蹄疫的控制具有重要意义。

口蹄疫病毒是第一例被发现的动物源病毒，属于小(微)RNA病毒科口蹄疫(疮)病毒属，有O、A、C、Asia1、SAT1–3共七个血清型，各血清型间鲜有免疫交叉保护，同一血清型的不同亚型间抗原性也存在差异、相互间的交叉保护力不等(Brown F.The History ofResearch in Foot-and-Mouth Disease.Virus Res.2003,91:3–7)。我国历史发生或当前流行的有O、A和Asia1型口蹄疫病毒，其中O型口蹄疫病毒的威胁最大，A型次之，2009年5月之后再无Asia1型口蹄疫临床病例(Bai X,et al.Evolution and MolecularEpidemiology of Foot-and-Mouth Disease Virus in China.Chinese Sci Bull.2011,56:2191–2201)。目前，我国已分离的O型口蹄疫病毒除历史代表株新疆阿克苏毒外，还包括中国古典型(Cathay)、泛亚-1(PanAsia-1)谱系、缅甸98(Mya98)谱系、印度2001d(IND2001d)分支(刘湘涛等.口蹄疫流行态势分析.中国兽医科学,2017,47(S1):45–49)。

疫苗免疫是预防口蹄疫的重要手段。口蹄疫疫苗的免疫效力主要有赖于疫苗毒种激发的体液免疫水平，即B细胞表位诱导中和抗体的能力(Barchrach HL.Immune andAntibody Responses to an Isolated Capsid Protein of Foot-and-Mouth DiseaseVirus.Immunol.1975,115:1636–1641)。此外，由T细胞表位介导的细胞免疫在预防口蹄疫病毒感染的后期也起着十分重要的作用(刘新生等.口蹄疫病毒T细胞表位研究概况.浙江农业科学,2010,(5):1113–1117)。

我国已有成熟生产技术工艺的口蹄疫疫苗包括灭活疫苗和合成肽疫苗。虽然合成肽疫苗能够规避灭活疫苗存在病毒逃逸的可能性和散毒风险，但其接种牛并不能获得完全的免疫保护，仅是在猪体上的试验是成功的[农业部公告第437号，2004]。而且，合成肽的抗原谱窄、免疫力有限，再有新的毒株入侵时，可能会出现免疫失败。现时(市)来看，还没有能与灭活疫苗的“物美价廉”相媲美的口蹄疫基因工程疫苗(刘在新.全球口蹄疫防控技术及病原特性研究概观.中国农业科学.2015,48:3547–3564)。欧盟和南美的一些国家经过几十年的口蹄疫病毒灭活疫苗的免疫接种，已经有效控制了口蹄疫，这被认为是用灭活疫苗防控口蹄疫的标杆(Sobrino F,et al.Foot-and-Mouth Disease Virus:a Long KnownVirus,but a Current Threat.Vet Res.2001,32:1–30)。虽然口蹄疫病毒具有显著的遗传变异特性，但与A型口蹄疫病毒相比，O型口蹄疫病毒的抗原性变异较小，疫苗毒株可以抵抗大多数田间流行毒株。譬如，欧美及亚洲一些国家和地区所用O型口蹄疫疫苗毒株仅限于和泛亚-1谱系同属中东-南亚拓扑型的O1Manisa和IND R2/75(亚洲)以及欧洲-南美拓扑型的O1K、O1BFS(欧洲)和O1Campos、O1Caseros(南美洲)，然而我国的O型口蹄疫疫苗生产用毒种及其组分繁杂多样(谢庆阁.口蹄疫.北京:中国农业出版社.2004)，这种内在免疫压力与外界环境因素的叠促作用加速了口蹄疫病毒在自然耐受条件下的准种优势正选择，十分不利于口蹄疫的净化与根除(Woodbury EL,et al.Analysis of Mixed Foot-and-MouthDisease Virus Infections in Saudi Arabia:Prolonged Circulation of an ExoticSerotype.Epidemiol Infect.1994,112:201–211)。

口蹄疫灭活疫苗中完整的146S病毒粒子作为最有效抗原，入侵机体时需要如树突状细胞(dendritic cells，DC)等抗原递呈细胞(antigen presenting cells，APC)的协助，并由主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)分子递送至(淋巴)细胞表面，树突状细胞作为口蹄疫病毒灭活疫苗的重要靶细胞，它对于调节机体免疫防御来说是必须的(Bayry J,et al.Interaction of Foot-and-Mouth Disease Virus withDendritic Cells.Trends Microbiol.2006,14:346–347)。灭活的口蹄疫病毒通过VP1G–H环中保守的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arginine-Glycine-Aspartic acid，RGD；第145～147位，以O型为例)三肽基序与细胞表面的整联蛋白(integrins，Ins)结合，启动并激活未成熟的牛骨髓树突状细胞凋亡系列信号通路，可能有损于免疫反应(Jin H,etal.Induction of Immature Dendritic Cell Apoptosis by Foot and Mouth DiseaseVirus is an Integrin Receptor Mediated Event before Viral Infection,J CellBiochem.2007,102:980–991)。但是，成熟的单核树突状细胞对整联蛋白结合的口蹄疫病毒感染并不敏感，中和的免疫复合物或灭活的口蹄疫病毒仍具有识别免疫细胞的能力(Robinson L,et al.Foot-and-Mouth Disease Virus Exhibits an Altered Tropism inthe Presence of Specific Immunoglobulins,Enabling Productive Infection andKilling of Dendritic Cells.J Virol.2011,85:2212–2223)。因此，以树突状细胞作为靶标细胞有助于发展有效的抗口蹄疫病毒疫苗。尽管目前关于口蹄疫病毒与树突状细胞相互作用的分子机制还不是很清楚，但是，硫酸乙酰肝素(heparan sulfate，HS)介导的内吞方式对于口蹄疫病毒在树突状细胞中的内在化作用来说最为有效，树突状细胞递呈抗原给淋巴细胞，诱导口蹄疫病毒特异的IgG反应。非硫酸乙酰肝素结合的病毒及其感染性RNA对树突状细胞结合也能诱导较低水平的特异性免疫反应(Harwood LJ,et al.Dendritic CellInternalization of Foot-and-Mouth Disease Virus:Influence of Heparan SulfateBinding on Virus Uptake and Induction of the Immune Response.J Virol.2008,82:6379–6394)。

口蹄疫病毒利用细胞表面受体的分子基础是位于病毒粒子表面的外部衣壳蛋白VP1–3中的特征性氨基酸序列或结构域。野生型口蹄疫病毒利用RGD基序识别整联蛋白，经网格蛋白介导的内吞作用路径侵染敏感组织细胞(O'Donnell V,et al.Analysis ofFoot-and-Mouth Disease Virus Internalization Events in Cultured Cells.JVirol.2005,79:8506–8518)。而细胞毒在适应过程中逐渐能够通过硫酸乙酰肝素吸附到细胞表面(Bai X,et al.Effects of Two Amino Acid Substitutions in the CapsidProteins on the Interaction of Two Cell-adapted PanAsia-1 Strains of Foot-and-Mouth Disease Virus Serotype O with Heparan Sulfate Receptor.VirolJ.2014,11:132)，某些口蹄疫病毒细胞适应株还会获得利用硫酸乙酰肝素作为受体的能力(Jackson T,et al.Efficient Infection of Cells in Culture by Type O Foot-and-Mouth Disease Virus Requires Binding to Cell Surface Heparan Sulfate.JVirol.1996,70:5282–5287)。肝素敏感型细胞适应毒通过小窝蛋白介导其完成细胞内在化过程(O'Donnell V,et al.Heparan Sulfate-Binding Foot-and-Mouth Disease VirusEnters Cells via Caveola-mediated Endocytosis.J Virol.2008,82:9075–9085)。导致口蹄疫病毒受体类型转换的氨基酸变异大多数位于靠近口蹄疫病毒粒子的五重轴、三重轴和五聚体(两重轴)界面上(Sobrino F,et al.Foot-and-Mouth Disease Virus:CurrentResearch and Emerging Trends.Norfolk:Caister Academic Press.2017)。

我国针对O型口蹄疫最有价值的疫苗毒株OZK/93能够利用硫酸乙酰肝素受体路径侵染宿主细胞BHK-21和CHO-K1(白兴文.我国O型泛亚1系口蹄疫病毒生物表型差异的分子基础.北京:中国农业科学院.2012)，但是它对少数亚型的O型口蹄疫病毒达不到完全交叉保护的免疫效果。某些利用硫酸乙酰肝素受体的口蹄疫病毒细胞适应株在宿主细胞上还可能会表现出致弱的毒力表型(但OZK/93等除外)。利用反向遗传操作对口蹄疫病毒B细胞表位，即抗原位点中的数个氨基酸进行定点突变可拓展口蹄疫疫苗株抗原谱[刘在新等.用反向遗传操作拓展口蹄疫疫苗株抗原谱及疫苗制备方法.ZL201010256781.22013.01.09]。但该基因工程毒rHN及其疫苗候选毒种丧失了侵染CHO-K1细胞的能力(Li P,etal.Evaluation of a Genetically Modified Foot-and-Mouth Disease Virus VaccineCandidate Generated by Reverse Genetics.BMC Vet Res.2012,8:57)，而且口蹄疫病毒T/B细胞表位中的某些(个)关键性氨基酸变异严格受限于抗体反应和细胞吸附的双重作用(Mateu MG,et al.A Single Amino Acid Substitution Affects Multiple OverlappingEpitopes in the Major Antigenic Site of Foot-and-Mouth Disease Virus ofSerotype C.J Gen Virol.1990,71:629–637)，进而可能显著影响种毒在口蹄疫疫苗生产用BHK-21细胞中的复制性能和病毒滴度及其中和抗体的交叉保护能力。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种O型口蹄疫病毒突变株及其制备方法和应用，所述O型口蹄疫病毒突变株中突变的氨基酸位于非T/B细胞表位上(如VP3G–H环)，所述O型口蹄疫病毒突变株具有诱导较强交叉保护水平中和抗体的能力。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种O型口蹄疫病毒突变株rHN^{D3173N+V3174E+N3179C}，以rHN病毒株作为母本病毒株，包括VP3蛋白的G–H环中以下氨基酸位点发生突变：第173位天冬氨酸突变为天冬酰胺，第174位缬氨酸突变为谷氨酸和第179位天冬酰胺突变为半胱氨酸。

本发明提供了所述的O型口蹄疫病毒突变株rHN^{D3173N+V3174E+N3179C}的制备方法，包括以下步骤：

(1)以pOFS质粒为模板，用OSEP3+和NEC-引物对进行PCR，得到A扩增产物，用NEC+和ONNP3'-引物对进行PCR，得到B扩增产物；

所述OSEP3+的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示；

所述NEC-的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示；

所述NEC+的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.3所示；

所述ONNP3'-的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示；

(2)以所述A扩增产物和B扩增产物为模板，用OSEP3+和ONNP3'-引物对进行融合PCR，得到VP3^{D173N+V174Y+N179C}>

(3)将所述VP3^{D173N+V174Y+N179C}>D173N+V174E+N179C质粒；

(4)将VP0基因片段、VP1+P2基因片段、5'UTR+L基因片段、P3+3'UTR基因片段克隆至所述pSK-VP3^{D173N+V174E+N179C}质粒中，得到pOFS^{D3173N+V3174E+N3179C}质粒；

(5)将所述pOFS^{D3173N+V3174E+N3179C}质粒线性化处理，将得到的线性质粒转染BSR/T7-5细胞，得到O型口蹄疫病毒突变株rHN^{D3173N+V3174E+N3179C}。

优选的，步骤(1)中A扩增产物或B扩增产物的PCR体系如下：10×LA Taq buffer 5μl，2.5mmol/L dNTP 5μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，模板0.5μl，LA Taq酶0.5μl，ddH₂O>

优选的，步骤(1)中A扩增产物或B扩增产物的PCR程序或步骤(2)中的融合PCR程序独立为：94℃5min；94℃1min、61℃1min 20s、72℃3min，30个循环；72℃10min。

优选的，步骤(3)中Spe I/Not I双酶切的反应体系如下：10×Basal buffer 5μl，模板25μl，Not I 5μl，Spe I 5μl，ddH₂O>

优选的，步骤(4)中扩增VP0基因片段所用的引物对为OSBP4+和OEP2-；所述OSBP4+的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.5所示；所述OEP2-的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO.6所示；

扩增VP1+P2基因片段所用的引物对为OS2A+/OBN-；所述OS2A+的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.7所示；所述OBN-的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.8所示；

扩增5'UTR+L基因片段所用的引物对为OST7+/OBL-；所述OST7+的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.9所示；所述OBL-的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.10所示。

扩增P3+3'UTR基因片段所用的引物对为3A'+/DNS-；所述3A'+的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.11所示；所述DNS-的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.12所示。

本发明提供了所述的O型口蹄疫病毒突变株rHN^{D3173N+V3174E+N3179C}或所述制备方法制备得到的O型口蹄疫病毒突变株rHN^{D3173N+V3174E+N3179C}在提高中和抗体交叉保护中的应用。

本发明提供了所述的O型口蹄疫病毒突变株rHN^{D3173N+V3174E+N3179C}或所述制备方法制备得到的O型口蹄疫病毒突变株rHN^{D3173N+V3174E+N3179C}在感染CHO系列细胞系中的应用。

本发明提供了所述的O型口蹄疫病毒突变株rHN^{D3173N+V3174E+N3179C}或所述制备方法制备得到的O型口蹄疫病毒突变株rHN^{D3173N+V3174E+N3179C}在免疫细胞抗原递呈中的应用。

本发明提供了一种基于所述的O型口蹄疫病毒突变株rHN^{D3173N+V3174E+N3179C}或所述制备方法制备得到的O型口蹄疫病毒突变株rHN^{D3173N+V3174E+N3179C}灭活的疫苗株。

本发明提供了一种O型口蹄疫病毒突变株rHN^{D3173N+V3174E+N3179C}，以rHN病毒株作为母本病毒株，将VP3蛋白的G–H环中以下氨基酸发生突变：第173位天冬氨酸突变为天冬酰胺，第174位缬氨酸突变为谷氨酸和第179位天冬酰胺突变为半胱氨酸。本发明借助口蹄疫病毒反向遗传操作技术平台成功拯救出O型口蹄疫病毒突变株rHN^{D3173N+V3174E+N3179C}，经RT-PCR验证，所述病毒突变株传至第10代成功扩增出目的条带，测序结果表明所述病毒突变株具有较好的遗传稳定性；一步生长曲线的结果显示：与母本病毒株rHN和单一的口蹄疫病毒定点突变株rHN^V3174Y(对比例1)比较，rHN^{D3173N+V3174E+N3179C}在BHK-21细胞上的增殖趋势相似，三者的复制动力学并未表现出明显的差异，说明特定位点的突变并未改变病毒在BHK-21细胞中的复制能力；用TCID₅₀测定结果表明，体外试验中所述病毒突变株未明显改变其对BHK-21细胞的感染性；同时，用LD₅₀测定结果表明，体内试验中所述病毒突变株对乳鼠的致病力明显减弱，与rHN^V174Y相比，rHN^{D3173N+V3174E+N3179C}的致弱效果更为明显；蚀斑形成试验以及间接免疫荧光和激光共聚焦显微镜检测结果说明，所述病毒突变株获得了小窝蛋白介导侵染CHO系列细胞系的能力。通过检测免疫阳性血清的交叉中和能力的结果表明，所述病毒突变株诱导产生的中和抗体的交叉保护能力显著提升，说明所述病毒突变株具有优异的抗原广谱性。

附图说明

图1为VP3定点突变的口蹄疫病毒基因组全长cDNA克隆构建示意图

图2为pOFS^V3174Y和pOFS^{D3173N+V3174E+N3179C}质粒及其病毒突变株的鉴定结果；图2A:M,DNA分子质量标准(1Kb)；1～3,依次为pOFS、pOFS^V3174Y和pOFS^{D3173N+V3174E+N3179C}质粒的Spe>V3174Y和rHN^{D3173N+V3174E+N3179C}扩增的RT-PCR产物；图2C:从左至右为rHN、rHN^V3174Y和rHN^{D3173N+V3174E+N3179C}VP3中编码第171～181位氨基酸的测序峰图；

图3为rHN、rHN^V3174Y和rHN^{D3173N+V3174E+N3179C}在BHK-21和CHO-K1细胞上的蚀斑形态；

图4为rHN、rHN^V3174Y和rHN^{D3173N+V3174E+N3179C}的一步生长曲线；

图5为rHN、rHN^V3174Y和rHN^{D3173N+V3174E+N3179C}接种BHK-21和CHO-K1细胞后有无口蹄疫病毒非结构蛋白3A表达的间接免疫荧光检测结果；

图6为rHN、rHN^V3174Y和rHN^{D3173N+V3174E+N3179C}侵染BHK-21和CHO-K1细胞的激光共聚焦显微镜检测结果；

图7为病毒中和试验测定免疫猪后第21天采集血清的中和抗体r值的方差分析。

具体实施方式

本发明提供了一种O型口蹄疫病毒突变株rHN^{D3173N+V3174E+N3179C}，以rHN病毒株作为母本病毒株，包括VP3蛋白的G–H环中以下氨基酸位点发生突变：第173位天冬氨酸突变为天冬酰胺，第174位缬氨酸突变为谷氨酸和第179位天冬酰胺突变为半胱氨酸。

在本发明中，所述rHN病毒株为利用口蹄疫病毒反向遗传操作技术平台拯救的O/HN/CHA/93(即OZK/93，经典疫苗株)基因工程毒。所述rHN病毒株已公开发表，具体见文章(Li P,et al.Evaluation of a Genetically Modified Foot-and-Mouth Disease VirusVaccine Candidate Generated by Reverse Genetics.BMC Vet Res.2012,8:57)。

在本发明中，所述突变的设计思路如下：

通过对口蹄疫病毒外部衣壳蛋白上影响原体内、间立体构象稳定性的相对保守的非T、B细胞表位区(突变的区段既不是口蹄疫病毒的T细胞表位区，也不是口蹄疫病毒B细胞表位区。从立体构象上来改造，不同于其他人通常都是选用通过对T细胞表位和/或B细胞表位改造来提升口蹄疫病毒的交叉中和能力)中潜在的靶点进行定点修饰，以特征性改变靶标氨基酸与其互作氨基酸的空间占位(位置)、所带的正负电荷、二硫键等分子间作用力的方式，来优化口蹄疫病毒最主要中和性抗原表位区(VP1 G–H环，即抗原位点1-1)的灵活性并提高其靶向递呈的效率；所述非T、B细胞表位区具体为但不限于VP3 G–H环，它在空间结构上靠近抗原位点1-1、1-2(VP1 C-末端)；定点修饰优选为突变，例如替换；所述特征性改变具体为定点修饰引发的氨基酸化学结构、极性、酸碱性等性质变化；所述靶向递呈为口蹄疫病毒识别抗原递呈细胞及其依赖于受体介导的内吞作用路径；树突状细胞等递呈抗原给淋巴细胞，诱导特异性的体液免疫和细胞免疫反应。

本发明提供了所述的O型口蹄疫病毒突变株rHN^{D3173N+V3174E+N3179C}的制备方法，包括以下步骤：

(1)以pOFS质粒为模板，用OSEP3+和NEC-引物对进行PCR，得到A扩增产物，用NEC+和ONNP3'-引物对进行PCR，得到B扩增产物；

所述OSEP3+的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示；

所述NEC-的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示；

所述NEC+的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.3所示；

所述ONNP3'-的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示；

(2)以所述A扩增产物和B扩增产物为模板，用OSEP3+和ONNP3'-引物对进行融合PCR扩增，得到VP3^{D173N+V174Y+N179C}>

(3)将所述VP3^{D173N+V174Y+N179C}>D173N+V174E+N179C质粒；

(4)将VP0基因片段、VP1+P2基因片段、5'UTR+L基因片段、P3+3'UTR基因片段克隆至所述pSK-VP3^{D173N+V174E+N179C}质粒中，得到pOFS^{D3173N+V3174E+N3179C}质粒；

(5)将所述pOFS^{D3173N+V3174E+N3179C}质粒线性化处理，将得到的线性质粒转染细胞，得到O型口蹄疫病毒突变株rHN^{D3173N+V3174E+N3179C}。

所述VP3定点突变的口蹄疫病毒基因组全长cDNA克隆的构建示意图如图1。

本发明以pOFS质粒为模板，分别用OSEP3+和NEC-、NEC+和ONNP3'-引物对进行PCR，得到A扩增产物和B扩增产物；

所述OSEP3+的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示；

所述NEC-的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示；

所述NEC+的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.3所示；

所述ONNP3'-的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示；

在本发明中，所述pOFS质粒是以pSK-HDV为载体，包含rHN母本病毒株(OZK/93的基因工程毒)基因组全长cDNA的重组质粒。所述pOFS质粒在现有技术中有报道(Li P,etal.Evaluation of a Genetically Modified Foot-and-Mouth Disease Virus VaccineCandidate Generated by Reverse Genetics.BMC Vet Res.2012,8:57)。

在本发明中，所述A扩增产物或B扩增产物的PCR体系优选如下：10×LA Taqbuffer 5μl，2.5mmol/L dNTP 5μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，模板0.5μl，LA Taq酶0.5μl，ddH₂O>

在本发明中，A扩增产物或B扩增产物的PCR程序独立优选为：94℃5min；94℃1min、61℃1min 20s、72℃3min，30个循环；72℃10min。

得到A扩增产物和B扩增产物后，本发明以所述A扩增产物和B扩增产物为模板，用OSEP3+和ONNP3'-引物对进行融合PCR，得到VP3^{D173N+V174Y+N179C}>

在本发明中，所述融合PCR的扩增程序优选为：94℃5min；94℃1min、61℃1min20s、72℃3min，30个循环；72℃10min。所述融合PCR的扩增体系优选为10×LA Taq buffer5μl，2.5mmol/L dNTP 5μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，A扩增产物0.5μl，B扩增产物0.5μl，LA Taq酶0.5μl，ddH₂O37.5μl。在本发明中，所述融合PCR用引物包括OSEP3+和ONNP3'-。

得到VP3^{D173N+V174Y+N179C}>D173N+V174Y+N179C>D173N+V174E+N179C质粒。

在本发明中，所述pSK-HDV载体在现有技术中有报道(曹伟军等.口蹄疫病毒O/HN/93疫苗株的拯救及病毒活性鉴定.华北农学报,2010,25(3):32-37)。

在本发明中，Spe I/Not I双酶切的反应体系优选如下：10×Basal buffer 5μl，模板25μl，Not I 5μl，Spe I 5μl，ddH₂O>

得到pSK-VP3^{D173N+V174E+N179C}质粒后，将VP0基因片段、VP1+P2基因片段、5'UTR+L基因片段、P3+3'UTR基因片段克隆至所述pSK-VP3^{D173N+V174E+N179C}质粒中，得到pOFS^{D3173N+V3174E+N3179C}质粒。

在本发明中，扩增VP0基因片段的模板为pOFS质粒。扩增VP0基因片段所用的引物对优选为OSBP4+和OEP2-；所述OSBP4+的核苷酸序列优选如序列表中SEQ ID NO.5所示；所述OEP2-的核苷酸序列优选如序列表中SEQ ID NO.6所示。扩增VP0基因片段的PCR体系同A扩增产物的PCR体系，不同之处在于：将10×LA Taq buffer(5μl)更换为5×PrimeSTART^TMHS>TM>2O减少至33μl。所述扩增VP0基因片段的PCR程序同A扩增产物的PCR程序。将得到的VP0基因片段和pSK-VP3^{D173N+V174E+N179C}质粒进行双酶切，双酶切产物回收、连接，得到pSK-VP0+VP3^{D173N+V174E+N179C}质粒。所述双酶切的反应体系同步骤(3)。所述反应体系中的限制性内切酶为Spe>

在本发明中，扩增VP1+P2基因片段的模板为pOFS质粒。扩增VP1+P2的基因片段所用的引物对优选为OS2A+/OBN-。所述OS2A+的核苷酸序列优选如序列表中SEQ ID NO.7所示；所述OBN-的核苷酸序列优选如序列表中SEQ ID NO.8所示。所述扩增VP1+P2基因片段的PCR体系同VP0基因片段的PCR体系。所述扩增VP1+P2基因片段的PCR程序同VP0基因片段的PCR程序。将得到的VP1+P2基因片段和pSK-VP0+VP3^{D173N+V174E+N179C}质粒分别进行双酶切，双酶切产物回收、连接，得到pSK-VP0+VP3^{D173N+V174E+N179C}+VP1+P2质粒。所述双酶切的反应体系同步骤(3)。所述VP1+P2基因片段双酶切反应体系中的限制性内切酶为Nhe>D173N+V174E+N179C质粒双酶切反应体系中的限制性内切酶为Spe>

在本发明中，扩增5'UTR+L基因片段的模板为pOFS质粒。扩增5'UTR+L基因片段所用的引物对优选为OST7+/OBL-；所述OST7+的核苷酸序列优选如序列表中SEQ ID NO.9所示；所述OBL-的核苷酸序列优选如序列表中SEQ ID NO.10所示。所述扩增5'UTR+L基因片段的PCR体系同VP0基因片段的PCR体系。所述扩增5'UTR+L基因片段的PCR程序同VP0基因片段的PCR程序。将得到的5'UTR+L基因片段和pSK-VP0+VP3^{D173N+V174E+N179C}+VP1+P2质粒进行双酶切，双酶切产物回收、连接，得到pSK-5'UTR+L+VP0+VP3^{D173N+V174E+N179C}+VP1+P2质粒。所述双酶切的反应体系同步骤(3)。所述反应体系中的限制性内切酶为Spe>

在本发明中，扩增P3+3'UTR基因片段的模板为pOFS质粒。扩增P3+3'UTR基因片段所用的引物对优选为3A'+/DNS-；所述3A'+的核苷酸序列优选如序列表中SEQ ID NO.11所示；所述DNS-的核苷酸序列优选如序列表中SEQ ID NO.12所示。所述扩增P3+3'UTR基因片段的PCR体系同VP0基因片段的PCR体系。所述扩增P3+3'UTR基因片段的PCR程序同VP0基因片段的PCR程序。将得到的P3+3'UTR基因片段和pSK-5'UTR+L+VP0+VP3^{D173N+V174E+N179C}+VP1+P2质粒进行双酶切，双酶切产物回收、连接，得到pSK-5'UTR+L+VP0+VP3^{D173N+V174E+N179C}+VP1+P2+P3+3'UTR，即pOFS^{D3173N+V3174E+N3179C}质粒。所述双酶切的反应体系同步骤(3)。所述反应体系中的限制性内切酶为BglII/NotI。

得到pOFS^{D3173N+V3174E+N3179C}质粒后，将所述pOFS^{D3173N+V3174E+N3179C}质粒线性化处理，将得到的线性质粒转染细胞，得到O型口蹄疫病毒突变株rHN^{D3173N+V3174E+N3179C}。

在本发明中，所述线性化处理用限制性内切酶优选为NotI。所述Not I的酶切体系同步骤(3)所述的反应体系，区别在于：限制性内切酶仅有Not I(5μl)，相应地，ddH₂O的体积增加至15μl。所述NotI的酶切条件同步骤(3)所述的酶切条件。

得到酶切产物后，优选将所述酶切产物进行回收，得到线性质粒。所述回收优选采用试剂盒进行。在本发明实施例中，所述试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司的琼脂糖凝胶回收和/或DNA片段纯化试剂盒。

本发明对所述线性质粒转染细胞没有特殊限制，采用本领域所熟知的转染方法即可。所述细胞优选为BSR/T7-5细胞。稳定表达T7 RNA聚合酶的BSR/T7-5细胞系由德国Karl-Klaus Conzelmann教授惠赠。

为了确定本发明制备的病毒突变株遗传是否稳定，本发明将所述pOFS^{D3173N+V3174E+N3179C}质粒进行线性化处理转染BSR/T7-5细胞，72h内收获转染的细胞及悬液。反复冻融三次，在BHK-21细胞上连续传代，直至90％以上细胞出现典型致细胞病变效应(cytopathic>

本发明还提供了在O型口蹄疫病毒VP3 G–H环中特定氨基酸突变的另一种方案，即rHN^V3174Y，以rHN为母本病毒株，将VP3>V3174Y质粒的制备方法是首先构建pOFS^V3174Y质粒。所述pOFS^V3174Y质粒的构建方法大体同pOFS^{D3173N+V3174E+N3179C}质粒的构建方法，区别在于：扩增VP3^V174Y的引物对为OSEP3+/3174Y-、3174Y+/ONNP3'-和OSEP3+/ONNP3'-。所述3174Y-的核苷酸序列如序列表中SEQ>D3173N+V3174E+N3179C质粒时的扩增体系和扩增程序。所述rHN^V3174Y，作为阳性对照说明本发明保护的rHN^{D3173N+V3174E+N3179C}的生物学特性。

为了鉴定所述病毒突变株的拯救是否成功及其生物学特性，进行了如下试验：蚀斑形成试验、一步生长曲线的绘制、TCID₅₀和LD₅₀的测定、间接免疫荧光和激光共聚焦显微镜检测。

其中蚀斑形成试验能够鉴定本发明所获得的基因工程毒的受体利用表型是否因为突变而发生改变。试验结果如下：与rHN相比，rHN^V3174Y和rHN^{D3173N+V3174E+N3179C}获得了感染CHO-K1细胞的能力。

一步生长曲线的结果显示：与母本病毒株rHN和单一的口蹄疫病毒定点突变株rHN^V3174Y比较，病毒突变株rHN^{D3173N+V3174E+N3179C}在BHK-21细胞上的增殖趋势相似，三者的复制动力学并未表现出明显的差异，说明特定位点的突变没有改变病毒在细胞中复制能力。

TCID₅₀的测定，TCID₅₀相当于体外试验，目的是为了鉴定所获得的基因工程毒对BHK-21细胞的致病变效应能力是否改变；TCID₅₀的测定结果显示，母本病毒株rHN与口蹄疫病毒突变株rHN^V3174Y和rHN^{D3173N+V3174E+N3179C}的TCID₅₀介于10^-6.500～10^-7.125之间，三者之间的差异并不显著，这一结果进一步佐证了O型口蹄疫病毒VP3>

LD₅₀的测定，LD₅₀相当于体内试验，目的是为了鉴定所获得的基因工程毒对乳鼠的致病力是否改变。LD₅₀的测定结果显示，与rHN相比，rHN^V3174Y和rHN^{D3173N+V3174E+N3179C}对乳鼠的致病力明显减弱，后者尤为明显。

同时，间接免疫荧光检测结果显示：rHN、rHN^V3174Y和rHN^{D3173N+V3174E+N3179C}在BHK-21细胞中均能正常复制、翻译，确证了O型口蹄疫病毒VP3G–H环中特定氨基酸突变使其获得了感染CHO-K1细胞的能力。

激光共聚焦检测结果显示：rHN、rHN^V3174Y和rHN^{D3173N+V3174E+N3179C}侵染BHK-21细胞依赖于网格蛋白和小窝蛋白介导的两种内吞作用路径；侵染CHO-K1细胞上，确实仅有rHN^V3174Y和rHN^{D3173N+V3174E+N3179C}与小窝蛋白共定位，说明两种口蹄疫病毒定点突变株侵染CHO-K1细胞应是依赖于小窝蛋白介导的内吞作用路径。

为了检测本发明提供的病毒突变株的抗原广谱性，检测病毒突变株灭活疫苗免疫阳性血清的交叉中和能力，结果发现，本发明提供的病毒突变株诱导机体(猪)产生的中和抗体的交叉保护能力显著提升。

本发明提供了所述的O型口蹄疫病毒突变株rHN^{D3173N+V3174E+N3179C}或所述制备方法制备得到的O型口蹄疫病毒突变株rHN^{D3173N+V3174E+N3179C}在增加抗体中和交叉保护中的应用。

本发明提供了所述的O型口蹄疫病毒突变株rHN^{D3173N+V3174E+N3179C}或所述制备方法制备得到的O型口蹄疫病毒突变株rHN^{D3173N+V3174E+N3179C}在感染CHO系列细胞系中的应用。

本发明提供了所述的O型口蹄疫病毒突变株rHN^{D3173N+V3174E+N3179C}或所述制备方法制备得到的O型口蹄疫病毒突变株rHN^{D3173N+V3174E+N3179C}在免疫细胞抗原递呈中的应用。

本发明提供了一种基于所述的O型口蹄疫病毒突变株rHN^{D3173N+V3174E+N3179C}或所述制备方法制备得到的O型口蹄疫病毒突变株rHN^{D3173N+V3174E+N3179C}灭活的疫苗株。

本发明对所述灭活的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的灭活方案即可。在本发明实施例中，向所述突变病毒株中按1:1(V/V)比例加入Montanide^TM>

所述口蹄疫病毒灭活疫苗在O型口蹄疫防治中的应用。

下面结合实施例对本发明提供的一种O型口蹄疫病毒突变株及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

原料来源的介绍

1.1质粒或细胞的来源

稳定表达T7RNA聚合酶的BSR/T7-5细胞系由德国Karl-Klaus Conzelmann教授惠赠。

BHK-21细胞(Ins+，HS+)和CHO-K1细胞(Ins-，HS+)分别引自中国典型培养物保藏中心和美国标准生物品收藏中心。

1.2主要试剂

LA Taq、PrimeSTART^TM>

E.coli JM109感受态细胞购自Transgene公司。

Opti-MEM I、Lipofectamine^TM>

氨苄青霉素-链霉素和0.25％Trypsin-EDTA均购自Gibco公司。

胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自Hyclone公司。

磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS；pH＝7.4)购自BiologicalIndustries公司。

RNeasy Mini Kit购自Qiagen公司。

黄蓍胶购自MP Biomedicals公司。

O型口蹄疫豚鼠抗血清、口蹄疫病毒非结构蛋白(non-structural proteins，NSPs)3A单克隆抗体(monoclonal antibody，McAb)由中国农业科学院兰州兽医研究所提供。

Clathrin(网格蛋白)重链McAb和兔源caveolin(小窝蛋白)多克隆抗体(polyclonal antibody，PcAb)购自ThermoFisher公司。

山羊抗豚鼠IgG H&L(647)购自Abcam公司。

FITC标记的山羊抗鼠IgG(H+L)和山羊抗兔IgG(H+L)购自北京康为世纪生物科技有限公司。

DAPI购自上海碧云天生物技术有限公司。

二乙烯亚胺、硫代硫酸钠，由中农威特生物科技股份有限公司惠赠。

Montanide^TM>

O型口蹄疫病毒液相阻断ELISA抗体检测试剂盒和口蹄疫病毒3ABC单抗阻断ELISA抗体检测试剂盒，由中国农业科学院兰州兽医研究所诊断中心提供。

O/rV-1株和O型O/BY/CHA/2010株口蹄疫病毒灭活疫苗免疫阳性血清(见表4)，由OIE/中国国家口蹄疫参考实验室提供。

1.3实验动物

1～3日龄乳鼠(昆明系)，由中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物中心提供。

18～22g小鼠(昆明系)，由中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物中心提供。

豚鼠(250～350g)，由中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物中心提供。

健康易感猪(25～40kg)，购自甘肃省定点猪场。

实施例1

VP3定点突变的口蹄疫病毒基因组全长cDNA克隆(pOFS^{D3173N+V3174E+N3179C}质粒)构建

第一步，首先，以pOFS质粒为模板，用OSEP3+/NEC-和NEC+/ONNP3'-进行PCR扩增，反应体系均为(总体积50μl)：10×LA Taq buffer 5μl，2.5mM dNTP 5μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，模板0.5μl，LA Taq酶0.5μl，ddH₂O>

然后，利用宝生物工程(大连)有限公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒获取目的产物。

表1构建口蹄疫病毒VP3定点突变基因组全长cDNA克隆所用的引物

以回收得到的两个片段为模板(OSEP3+/NEC-和NEC+/ONNP3'-扩增产物)，利用融合PCR，以OSEP3+/ONNP3'-为引物对扩增目的产物，得到VP3^{D173N+V174Y+N179C}>

第二步：酶切连接

以Spe I/Not I双酶切pSK-HDV载体和VP3^{D173N+V174Y+N179C}>2O>D173N+V174Y+N179C>D173N+V174E+N179C质粒。

第三步：以pOFS质粒为模板，以OSBP4+/OEP2-为引物对，扩增VP0基因片段。反应体系同第一步，区别是：将10×LA Taq buffer(5μl)更换为5×PrimeSTART^TM>TM>2O减少至33μl。反应程序同上。回收条件同上。

然后，以Spe I/EcoR I双酶切扩增的VP0基因片段、pSK-VP3^{D173N+V174E+N179C}质粒。反应体系和反应条件同第二步。回收，连接。反应体系为(总体积10μl)：2×ligase>D173N+V174E+N179C>D173N+V174E+N179C质粒。

第四步：以pOFS质粒为模板，OS2A+/OBN-为引物对，扩增VP1+P2目的产物。反应体系和反应程序同第三步。回收VP1+P2基因片段。

然后，以Nhe I/Not I双酶切扩增的VP1+P2基因片段，以Spe I/Not I双酶切pSK-VP0+VP3^{D173N+V174E+N179C}质粒(Nhe>D173N+V174E+N179C>D173N+V174E+N179C+VP1+P2质粒。

第五步：以pOFS质粒为模板，OST7+/OBL-为引物对，扩增5'UTR+L基因片段。反应体系的反应程序同第三步。回收扩增产物。

然后，以Spe I/BamH I双酶切扩增的5'UTR+L基因片段和pSK-VP0+VP3^{D173N+V174E+N179C}+VP1+P2质粒。反应体系和反应条件同第三步。回收酶切产物，连接。连接的反应体系为(总体积10μl)：2×ligase>D173N+V174E+N179C+VP1+P2>D173N+V174E+N179C+VP1+P2质粒。

第六步：以pOFS质粒为模板，3A'+/DNS-为引物对，扩增P3+3'UTR基因片段。反应体系和反应程序同第三步。回收扩增产物。

然后，以Bgl II/Not I双酶切扩增的P3+3'UTR基因片段和pSK-5'UTR+L+VP0+VP3^{D173N+V174E+N179C}+VP1+P2质粒。反应体系和反应条件同第三步。回收酶切产物，连接，连接反应体系为(总体积10μl)：2×ligase>D173N+V174E+N179C+VP1+P21μl，T4DNA>D173N+V174E+N179C+VP1+P2+P3+3'UTR质粒，即pOFS^{D3173N+V3174E+N3179C}质粒。

最终，将经Spe I/Not I双酶切鉴定结果正确的pOFS^{D3173N+V3174E+N3179C}质粒送寄北京六合华大基因科技股份有限公司进行序列测定。

对比例1

分别以OSEP3+/3174Y-和3174+/ONNP3'-为两对引物对，以pOFS质粒为模板，PCR得到C扩增片段和D扩增片段，所述扩增体系和扩增程序同实施例1中第一步的方案。按照实施例1中第一步的方案进行融合PCR，得到VP3^V174Y，按照实施例1中第二步到第六步的方案实施，得到pOFS^V3174Y质粒。

实施例2

将实施例1和对比例1中测序结果正确的pOFS^{D3173N+V3174E+N3179C}质粒和pOFS^V3174Y用NotI分别进行酶切和片段回收，得到线性化处理的两种质粒。

按Lipofectamine^TM>

以pOFS质粒作为阳性对照，对构建的pOFS^V3174Y和pOFS^{D3173N+V3174E+N3179C}质粒分别进行Spe>

pOFS^V3174Y和pOFS^{D3173N+V3174E+N3179C}质粒分别经Not>V3174Y和rHN^{D3173N+V3174E+N3179C}。

实施例3

蚀斑形成试验

将rHN及rHN^V3174Y和rHN^{D3173N+V3174E+N3179C}病毒突变株进行10倍系列稀释，分别接种于6孔板中培养的单层BHK-21和CHO-K1细胞(200μl/孔)，37℃、1h，期间间隔10～15min轻轻晃动1次，使细胞表面保持浸润。随后，吸弃接种液，每孔覆盖2ml>

蚀斑形成试验结果表明，在BHK-21细胞上，与母本病毒株rHN相比，单一的口蹄疫病毒定点突变株rHN^V3174Y的蚀斑形态稍有变大、复制水平略有提高，而病毒突变株rHN^{D3173N+V3174E+N3179C}的蚀斑形态趋于变小、复制能力减弱，但统计学分析差异并不显著(图3、表2)。rHN在CHO-K1细胞上不能形成蚀斑，而rHN^V3174Y和rHN^{D3173N+V3174E+N3179C}在CHO-K1细胞上均能够形成蚀斑(图3、表2)。

表2蚀斑形成试验结果

实施例4

一步生长曲线的绘制

按1.0MOI(multiplicity of infection，感染复数)将rHN及rHN^V3174Y和rHN^{D3173N+V3174E+N3179C}病毒突变株分别接种至BHK-21细胞，4℃吸附1h后，吸弃接种液，再重新加入不含FBS的DMEM培养基，37℃孵育至第2、4、6、8、9、10、12、16、20、24h时分别收获病毒。反复冻融3次后，依照1.6项测定PFU，绘制一步生长曲线。

结果见图4：rHN、rHN^V3174Y和rHN^{D3173N+V3174E+N3179C}的一步生长曲线。由图4可知，rHN、rHN^V3174Y和rHN^{D3173N+V3174E+N3179C}的一步生长曲线基本一致，这说明rHN^V3174Y和rHN^{D3173N+V3174E+N3179C}的特定位点的突变并未影响该病毒株的自我复制能力。

实施例5

1、TCID₅₀的测定

将BHK-21细胞制成2×10⁶/ml的悬液，与10倍系列稀释的rHN、rHN^V3174Y和rHN^{D3173N+V3174E+N3179C}各取50μl加入96孔板中(8孔/稀释度)，选择10^-4～10^-6三个梯度，然后置37℃、CO₂培养箱至72h。吸弃培养基，用10％福尔马林溶液固定30min、0.05％亚甲基蓝溶液染色30min后冲洗，待自然干燥后，统计病变孔数，按照法计算TCID₅₀。

2、LD₅₀的测定

各取10^-4～10^-8稀释的rHN和两种口蹄疫病毒突变株皮下接种1～3日龄乳鼠(200μl/只，5只/稀释度)，观察乳鼠的发病情况，至第7天，统计乳鼠的死亡数，按照Reed-Muench法计算LD₅₀。

测定TCID₅₀是为了了解获得的基因工程毒对BHK-21细胞的致病变效应能力是否改变，相当于体外试验。测定LD₅₀是为了了解所获得的基因工程毒对乳鼠的致病力是否改变，相当于体内试验。

TCID₅₀的测定结果显示，母本病毒株rHN与两种病毒突变株rHN^V3174Y和rHN^{D3173N+V3174E+N3179C}的TCID₅₀介于10^-6.500～10^-7.125之间，三者之间的差异并不显著，这一结果进一步佐证了O型口蹄疫病毒VP3G–H环中特定氨基酸突变确未明显改变其对BHK-21细胞的感染性(表2)。LD₅₀的测定结果显示，与rHN相比，rHN^V3174Y和rHN^{D3173N+V3174E+N3179C}对乳鼠的致病力明显减弱，后者尤为明显(下降10倍以上，见表2)。

实施例6

间接免疫荧光试验

将rHN及rHN^V3174Y和rHN^{D3173N+V3174E+N3179C}分别接种到BHK-21或CHO-K1细胞上，置37℃、CO₂培养箱中。4～8h后，吸弃接种液，4％多聚甲醛固定30min，0.2％TritonX-100通透15min，5％BSA封闭1h，加入口蹄疫病毒3AMcAb(3A24，1:400)、37℃温育1h，再加入FITC标记的山羊抗鼠IgG(1:50)反应1h。加入DAPI(1:10000)染核5min。每一步骤完成后均用PBS洗涤3～5次。最后，置荧光倒置显微镜(EVOS>

间接免疫荧光检测结果显示，母本病毒株与病毒突变株接种BHK-21细胞4h后，均能观察到因3A24(McAb)识别口蹄疫病毒3A后与FITC标记的宿主特异性IgG发生反应而产生的绿色荧光，表明rHN、rHN^V3174Y和rHN^{D3173N+V3174E+N3179C}在BHK-21细胞中均能正常复制、翻译(图5)。但是，rHN、rHN^V3174Y和rHN^{D3173N+V3174E+N3179C}接种CHO-K1细胞4～8h后，仅有前者未能检测到口蹄疫病毒3A蛋白的表达，从而确证了O型口蹄疫病毒VP3G–H环中特定氨基酸突变使其获得了感染CHO-K1细胞的能力(图5)。

实施例7

激光共聚焦显微镜检测

按100MOI将rHN及其两种病毒突变株分别接种于BHK-21或CHO-K1细胞。37℃孵育15min后，吸弃接种液，PBS洗涤3次。依次加入O型口蹄疫豚鼠抗血清(1:500)、Clathrin重链McAb(1:500)或兔源caveolin PcAb(1:200)，647标记的山羊抗豚鼠IgG H&L(1:400)、FITC标记的山羊抗鼠或抗兔IgG(1:50)，37℃条件下各作用1h。DAPI染核5min、PBS洗涤5～8次、50％甘油封片后，置激光共聚焦显微镜(TCS SP8)下观察。

激光共聚焦检测结果显示，母本病毒株与两种病毒突变株接种BHK-21细胞15min后，均分别能观察到口蹄疫病毒与clathrin和caveolin共定位，说明rHN、rHN^V3174Y和rHN^{D3173N+V3174E+N3179C}侵染BHK-21细胞依赖于网格蛋白和小窝蛋白介导的两种内吞作用路径(图6)。但在CHO-K1细胞上，确实仅有rHN^V3174Y和rHN^{D3173N+V3174E+N3179C}与caveolin共定位，说明两种病毒突变株侵染CHO-K1细胞应是依赖于小窝蛋白介导的内吞作用路径。

实施例8

口蹄疫病毒代表株

Mya98谱系：O/BY/CHA/2010(也是当前O型口蹄疫疫苗生产用代表性毒种之一)，GenBank登录号JN998095(Zheng H,et al.Genetic Characterization of a NewPandemic Southeast Asia Topotype Strain of Serotype O Foot-and-Mouth DiseaseVirus Isolated in China during 2010.Virus Genes.2012,44(1):80–88)。

泛亚-1谱系代表株：O/CHA/7/2011，GenBank登录号JF837375。

Cathay拓扑型代表株：O/SCGH/CHA/2016，GenBank登录号KX161429。

IND2001d分支代表株：O/XJ/CHA/2017，GenBank登录号：MF461724(Zhu Z,etal.First Detection of Foot-and-Mouth Disease Virus O/ME-SA/Ind2001inChina.Transbound Emerg Dis.2018May 9.doi:10.1111/tbed.12895)。

O/rV-1毒株为申请人新申请获得的一个国家发明专利和一类新兽药注册证书中所涉及的一株口蹄疫基因工程病毒，以国家发明专利和新兽药注册证书形式公开。国家发明专利的授权号为ZL201210035986.7。新兽药名称为猪口蹄疫O型病毒3A3B表位缺失灭活疫苗(O/rV-1株)，证号为(2017)新兽药证字50号，研制单位为中国农业科学院兰州兽医研究所、中牧实业股份有限公司、中农威特生物科技股份有限公司，发证日期：2017年10月16日。

将上述代表性口蹄疫病毒株和第10代的rHN、rHN^V3174Y和rHN^{D3173N+V3174E+N3179C}(共8株)作为研究材料，按照实施例5的方法测定各病毒株的TCID₅₀，结果见表4。

1)口蹄疫病毒抗原的制备及安全性检验

将第10代rHN、rHN^V3174Y和rHN^{D3173N+V3174E+N3179C}进行灭活，分别加入二乙烯亚胺至终浓度3mmol/L，30℃作用48h，期间不间断搅拌或振摇。加入硫代硫酸钠至终浓度1.2％～2.0％，充分搅拌，使过量的灭活剂被阻断。

随后，对以上3种O型口蹄疫病毒抗原取样用于安全性检验(其余样品迅速冷却至4℃以下并保存)：各用小鼠5只，皮下注射灭活抗原0.5ml/只；各用豚鼠2只，皮下注射灭活抗原2ml/只。连续观察7日，均未出现因口蹄疫病毒感染所引起的典型临床症状。

2)口蹄疫病毒灭活疫苗的配制

待灭活抗原的安全性检验合格后，按1:1(V/V)比例加入Montanide^TM>

3)免疫阳性血清

用上述3种O型口蹄疫病毒灭活疫苗分别免疫猪各2头(O型口蹄疫病毒液相阻断ELISA抗体效价不高于1:8和3ABC抗体检测为阴性)，分别于免疫后7、14、21天采血，37℃放置1h后，于4℃过夜。8000rpm、离心15min，收集血清。

4)O型口蹄疫病毒液相阻断ELISA抗体检测

按O型口蹄疫病毒液相阻断ELISA抗体检测试剂盒说明书进行如下操作：

取待检猪血清各100μl，用PBST进行2×系列稀释(阴、阳性对照血清进行相同操作)。

将1:4～1:512的待检血清按列加入96孔板中，50μl/孔；设立阴、阳性对照(阴性对照血清，1:1～1:8；阳性对照血清，稀释度为1:2～1:256)和病毒抗原对照孔(4孔)。

将病毒抗原用PBST(含Tween-20)稀释至工作浓度(1:25)，加入血清稀释孔(50μl/孔)和病毒抗原对照孔(100μl/孔)中；封板、振荡，4℃静置过夜或37℃孵育90min。

将抗原-抗体复合物从96孔板中按次序转移至已包被O型口蹄疫病毒兔抗(体)的ELISA板上，50μl/孔；封板，37℃孵育60min。

用PBST连续洗板3～5次，拍干；加入O型口蹄疫病毒豚鼠抗体工作液，50μl/孔；封板，37℃孵育30min。

用PBST连续洗板3～5次，拍干；加入兔抗豚鼠IgG-HRP工作液，50μl/孔；封板，37℃孵育30min。

用PBST连续洗板3～5次，拍干；将TMB底物A溶液和B溶液混合(1:1，V/V)、摇匀，按50μl/孔的量加入该混匀后的底物溶液，置37℃孵育15min(显色反应)。

待显色反应结束后，加入终止液(50μl/孔)终止反应；在酶标仪上读取OD450nm值。

以病毒抗原对照孔的OD₄₅₀nm值为临界值，判定待检血清的抗体效价。

待检猪血清的ELISA抗体效价结果见表3。

表3O型口蹄疫病毒液相阻断ELISA抗体检测结果

3种O型口蹄疫病毒灭活疫苗免疫动物第7天，均有O型口蹄疫病毒特异性ELISA抗体的产生。至第14天，口蹄疫疫苗免疫猪的O型口蹄疫病毒特异性ELISA抗体水平都有所上升；21天后，所有免疫猪的抗体水平均≥1:90(表3)。

5)病毒中和实验(Virus Neutralization Test，VNT)

选择O型口蹄疫病毒液相阻断ELISA抗体效价≥1:128的免疫阳性血清，进行病毒中和实验，以研判免疫阳性血清对O型不同基因型口蹄疫病毒的交叉中和能力。具体步骤如下(重复三次)：

将试验毒株分别稀释至1000TCID₅₀、100TCID₅₀、10TCID₅₀和0.1TCID₅₀；选取100TCID₅₀稀释度分别加入96孔板(50μl/孔)的第1～10列中，第11、12列分别加入4孔1000TCID₅₀、100TCID₅₀、10TCID₅₀和0.1TCID₅₀的病毒液。

将选定的口蹄疫疫苗免疫阳性血清于56℃作用30min，用DMEM基础培养液进行2×系列稀释；各加入一行上述96孔板中(1:2～1:1024，50μl/孔)，第11、12列加入DMEM基础培养液(50μl/孔)；置CO₂细胞培养箱中，37℃作用1h。

将BHK-21细胞悬液(2×10⁶个细胞/ml，约10ml)加入上述96孔板中、50μl/孔，置37℃，CO₂细胞培养箱中，孵育72h。

吸弃96孔板中的液体，固定、染色，判定结果(Reed-Muench法)。

结果见表4。

表4待检猪血清的抗体效价结果

5种免疫阳性血清对8种口蹄疫病毒的VNT结果统计显示，猪口蹄疫病毒O型3A3B表位缺失灭活疫苗生产用毒种O/rV-1株的免疫阳性血清对O型Cathay拓扑型、Mya98、PanAsia-1谱系和IND2001d分支口蹄疫病毒的中和能力均较好(r值>0.3)，O/BY/CHA/2010免疫阳性血清对其他基因型口蹄疫病毒的中和能力稳定在0.31～0.85之间(r值)；但是，rHN免疫阳性血清对PanAsia-1谱系口蹄疫病毒的中和能力较差(r值介于0.08～0.14)，VP3上V174Y导致其对Mya98谱系以及PanAsia-1谱系和IND2001d分支口蹄疫病毒的中和能力分别有所下降和上升；值得关注的是，rHN^{D3173N+V3174E+N3179C}免疫阳性血清对O型四个基因型口蹄疫病毒的中和能力均有显著提升，且其r值均大于0.50(表4)。

OIE陆生动物诊断试验与疫苗手册推荐，理想的口蹄疫疫苗制备种毒不仅要有良好的生产性能(在BHK-21细胞上的病变时间短、遗传稳定等)，而且体外对同一血清型不同基因型口蹄疫病毒的中和水平和免疫效力分别应满足r值不低于0.3的要求(OIE，2012)。对VNT结果进行方差分析，rHN VP3上D173N+V174E+N179C能够显著提高口蹄疫病毒免疫阳性血清的交叉中和能力，暗示rHN^{D3173N+V3174E+N3179C}遗传稳定株可能具有对O型Cathay拓扑型、Mya98和PanAsia-1谱系以及IND2001d分支口蹄疫病毒很好的交叉攻毒保护(图7)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 一种O型口蹄疫病毒突变株及其制备方法和应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tactagtgaa ttcccttcca aggaggggat ctt 33

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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<210> 3

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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<210> 4

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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<210> 5

<211> 39

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<210> 6

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

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<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

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<210> 8

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

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<210> 9

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<210> 10

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<210> 14

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<210> 15

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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acctccgacg ggtggtacgc 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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