一种用于检测MLL-AF4融合基因的试剂盒

摘要

本发明涉及一种用于检测MLL‑AF4融合基因的试剂盒，包括MLL‑AF4融合基因扩增检测试剂组，所述MLL‑AF4融合基因扩增检测试剂组包括用于扩增MLL‑AF4融合基因的引物对和检测探针。本发明的试剂盒设计了适用于基于微滴式数字PCR系统的引物和探针，以及相应的对照，使其能够用于基于微滴式数字PCR系统的检测系统。检测流程的自动化程度高，效果好，操作非常简便易上手，适宜临床应用及推广。

说明书

技术领域

本发明涉及MLL-AF4融合的检测领域，更特别地，涉及一种用于检测MLL-AF4融合基因的试剂盒。

背景技术

MLL(mixed lineage leukemia)基因异常是急性白血病中一种十分常见的染色体异常，大多数发生MLL基因异常的急性白血病的预后很差，其中由t(4；11)(q21；q23)易位而形成的MLL-AF4融合基因是急性淋巴细胞白血病中第二大常见的染色体异常,多数患者对常规化疗耐药，即使做异基因造血干细胞移植也容易复发，是一个独立的预后不良因素。

当前国内外广泛使用的分子生物学检测MLL-AF4融合基因的方法中，荧光原位杂交技术(FISH)虽然结果较为直观，但只能进行定性检测且操作复杂，需要荧光显微镜等大型仪器设备和病理医生的诊断意见，对检测机构的要求较严格，不利于临床样本的快速检出。传统的固相生物芯片(Biochip)或基因芯片技术存在着可重复性差、灵敏度不够好以及操作繁琐，成本高的突出弱点。焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)是新一代DNA序列分析技术，虽具备同时对大量样品进行测序分析的能力，是高通量、低成本、快速、直观地进行核苷酸分析和临床检验的理想的技术平台，但也只适合基因筛查，不适合进行单种融合基因的定量检测。最常用的荧光定量PCR虽能进行单重融合基因的定量实验，但是需要建立标准曲线，成本较高，而且其对微小残留的检测还是比较困难，对于融合比例极低的阳性样本的漏检率很高。

因此，需要一种能够满足临床上最新的诊疗需求，并且操作简便、结果准确、成本低廉和高通量的新型MLL-AF4融合基因检测试剂盒。

发明内容

为解决以上问题，本发明提供了一种用于检测MLL-AF4融合的试剂盒，包括MLL-AF4融合基因扩增检测试剂组，所述MLL-AF4融合基因扩增检测试剂组包括用于扩增MLL-AF4融合基因的引物对和检测探针。

在一个优选实施方案中，用于扩增MLL-AF4融合基因的引物对的序列如SEQ IDNO:1-4所示，检测MLL-AF4融合基因的探针的序列如SEQ ID NO:5所示。

在一个优选实施方案中，所述MLL-AF4融合基因扩增检测试剂组制成用于检测MLL-AF4融合基因的引物探针预混合液，所述MLL-AF4融合基因的引物探针预混合液中每条引物的浓度为500nM-1000nM，探针的浓度为200nM-400nM。

在一个优选实施方案中，所述试剂盒还包括参考基因扩增检测试剂组，所述参考基因扩增检测试剂组包括用于扩增参考基因的引物对和检测探针。

在一个优选实施方案中，所述参考基因为ABL基因。

在一个优选实施方案中，用于扩增ABL基因的引物对的序列如SEQ ID NO:6和7所示，检测ABL基因的探针的序列如SEQ ID NO:8所示。

在一个优选实施方案中，所述试剂盒还包括阳性对照和/或阴性对照，所述阳性对照为含有不低于500拷贝/μL的MLL-AF4融合基因的溶液，所述阳性对照为不含MLL-AF4融合基因或MLL-AF4融合基因低于10拷贝数/μL的溶液。

在一个优选实施方案中，所述阳性对照和阴性对照中均含有不低于1000拷贝/μL的ABL基因。

在一个优选实施方案中，所述试剂盒还包括反转录酶和DTT。

在一个优选实施方案中，所述试剂盒还包括用于PCR反应的试剂。

市售的试剂盒无法对样本进行准确定量，灵敏度较低。本发明的试剂盒设计了适用于基于微滴式数字PCR系统的引物和探针，以及相应的对照，使其能够用于基于微滴式数字PCR系统的检测系统。在检测过程中，将每一个样本的20μL反应液乳化分成20000个独立的微滴，对浓度较低的样本来说，每个微滴中包含的MLL-AF4或ABL拷贝数为1或0，通过专用软件自动检测每个微滴的荧光信号，再计数总的阳性微滴数，就能得到准确的MLL-AF4拷贝数，浓度较高的样本只需进行一定比例的稀释，也能得到准确的结果。检测流程的自动化程度高，效果好，操作非常简便易上手，适宜临床应用及推广。在微小残留检测方面，qPCR较为困难，对于比例较低的融合基因样本来说，市售试剂盒的漏检概率较大，而本发明的试剂盒具备高灵敏度与高准确性，漏检率少，可以直接发布结果，最大程度的提高了发布报告的时间，为临床医生提供快速、准确的辅助用药指导。

附图说明

图1为阳性对照品检测结果图；

图2为阴性对照品检测结果图；

图3为1例MLL-AF4患者检测结果图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

1.引物和探针设计

用于扩增MLL-AF4的引物以及相应的检测探针如下：

MLL-F1(SEQ ID NO:1)：5′-caaacagaaaaaagtggctcc-3′；

MLL-F2(SEQ ID NO:2)：5′-gttctaagcaaaaaattccagc-3′；

MLL-F3(SEQ ID NO:3)：5′-gtgccagtagtgggcatgtaga-3′；

AF4-Ru(SEQ ID NO:4)：5′-gctgtactaggcgtatgtattgct-3′；

检测探针MLL-AF4-P1_FAM(SEQ ID NO:5)：5′-tgaatgggtcatttccttc-3′；

其中，探针P MLL-AF4(SEQ ID NO:5)的5’端标记FAM荧光基团，3’端标记MGB淬灭基团。

用于扩增ABL的引物以及相应的检测探针如下：

ABL1-F(SEQ ID NO:6)：5′-gccagggagagagcgatc-3′；

ABL1-R(SEQ ID NO:7)：5′-gagggagcaatggagacacg-3′；

检测探针ABL-P_VIC(SEQ ID NO:8)：5′-ctggaccatgagcctg-3′；

其中，探针ABL-P_VIC(SEQ ID NO:8)的5’端标记VIC荧光基团，3’端标记MGB淬灭基团。

2.体系反应液的配制

1)PCR反应液：包含相应浓度的DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液、dATP、dCTP、dTTP和dGTP等；Reverse>

2)引物探针预混合液：将引物及探针各自用双蒸水溶解，每条引物的浓度为100μM，每条探针的浓度为10μM；将MLL-F1、MLL-F2、MLL-F3、AF4-Ru和MLL-AF4-P1_FAM的母液以9:9:9:25的比例混合；将ABL1-F、ABL1-R和ABL-P_VIC的母液以9:9:25的比例混合；最终形成引物/探针在反应体系中的浓度为900nM/250nM。

3)阳性对照模板：经测序确认的包含MLL-AF4融合基因的质粒和ABL基因的质粒的溶液。

4)阴性对照模板：经测序确认的仅包含ABL基因的质粒的溶液。

3.检测方法

仪器：Eppendorf Mastercycler pro S定性PCR仪，Bio-rad QX200微滴式数字PCR系统(包括微滴生成仪、封膜仪、微滴读取仪)，BECKMAN22R台式微量冷冻离心机，WH-866型涡旋振荡器，低速板式离心机。

采集血液样本，用QIAGEN公司QIAamp RNA Blood Mini Kit(货号52304)，按照试剂盒说明书操作，从血液样本中提取RNA；将得到的RNA作为模板进行检测。具体步骤如下：

1)10体积PCR反应液、2体积引物探针预混合液和4体积ddH₂O混匀，10000rpm瞬时离心10s，分装成16μL反应体系加入到八联PCR反应管中，传至样本制备区；

2)向反应孔中加入样品核酸模板4μL(若模板保存在-20℃，使用前置室温解冻，以10000rpm离心10s)，阳性对照孔加阳性对照模板，阴性对照孔加阴性对照模板，空白对照孔加双蒸水。盖上八联管盖，涡旋震荡，板式离心机2000rpm离心1min。

3)将八联PCR管中的20μL PCR反应液转移至QX200微滴生成仪专用卡夹(共有三行，每行8孔，依次为微滴行、样本行和生成油行)的样品行的8孔中，生成油行对应的8孔加入配套的微滴生成油70μL(Bio-rad公司，货号1863005)，放入微滴生成仪中，自动生成微滴于上方微滴行。

4)将生成的40μL微滴转移至96孔PCR反应板，封膜仪封铝膜，放入定性PCR仪中，反应条件如下：95℃10min；40个循环(94℃30s，55℃60s)，98℃10min；4℃保存。

结果分析具体包括如下步骤：

1)简单设置每个反应孔样本信息，开始运行，仪器会自动对每个孔的约20000个微滴进行荧光读取和分析，并自动计算浓度结果，也可手动微调：

检测合格标准：

阳性对照：ABL质粒≥1000拷贝/μl，MLL-AF4融合基因质粒≥100拷贝/μl；

阴性对照：ABL质粒大于≥1000拷贝/μl，MLL-AF4融合基因小于10拷贝/μl。

样本结果：样本中MLL-AF4/ABL基因的准确融合比值计算公式如下：

(1)若样本中MLL-AF4融合基因拷贝>10，人ABL基因拷贝数≥1000则样本为阳性，若样本中MLL-AF4融合基因拷贝数≤10，人ABL基因拷贝数≥1000则样本为阴性。

(2)如果样本中MLL-AF4或者ABL浓度过高，导致测试孔中浓度结果超过5000拷贝/μl，则对应原始样本中超过1*10⁵拷贝/μl，为了达到最佳准确性，需对样本进行稀释10倍，再进行检测。

4.部分临床样本检测

按以上方法对自制标准品(经测序确认的MLL-AF4融合基因质粒与ABL基因质粒混合)和部分临床患者样本的进行检测，结果与市售的性能最佳的MLL-AF4融合基因检测试剂盒，市售基于荧光定量PCR方法的检测试剂盒进行比对，结果如表1以及图1-3所示。

图1为图1为阳性对照品检测结果图。Ch1通道为FAM通道，检测MLL-AF4拷贝数，紫色直线为阈值线，2000以上的蓝色荧光点即为MLL-AF4阳性微滴，计算机自动换算成拷贝浓度；Ch2通道为VIC通道，检测内参基因ABL基因拷贝数，紫色直线为阈值线，2000以上的绿色荧光点即为ABL基因阳性微滴，计算机自动换算成拷贝浓度。

图2为阴性对照品检测结果图。Ch1通道为FAM通道，检测MLL-AF4拷贝数，无阳性微滴，荧光信号均低于2000；Ch2通道为VIC通道，检测内参基因ABL基因拷贝数，紫色直线为阈值线，2000以上的绿色荧光点即为ABL基因阳性微滴，计算机自动换算成拷贝浓度。

图3为1例MLL-AF4患者检测结果图。Ch1通道为FAM通道，检测MLL-AF4拷贝数，紫色直线为阈值线，2000以上的蓝色荧光点即为MLL-AF4阳性微滴，计算机自动换算成拷贝浓度；Ch2通道为VIC通道，检测内参基因ABL基因拷贝数，紫色直线为阈值线，2000以上的绿色荧光点即为ABL基因阳性微滴，计算机自动换算成拷贝浓度。该患者样本中融合比率为：67.3％。

表1临床样品检测结果统计表

在对70例临床样本进行的比对实验显示，本发明试剂盒检出23例阳性样本，比市售试剂盒多检出3例，通过定性PCR后的测序验证，这2例阳性样本为MLL-AF4融合基因比例极低的阳性样本，这说明相比较市售试剂盒而言而言，本发明的阳性漏检率更低，检测的准确率更高，灵敏度也更高，这对于样本中的MLL-AF4融合基因的检测及治疗后样本的微小残留病检测有很大的意义。在实验方面，本发明的试剂盒使用ddPCR法，采用单孔双通道检测三型，与市售试剂盒采用的需要三型三孔检测并且还要建立标准曲线的qPCR法相比，本发明试剂盒操作简便快捷，自动化程度高，成本低，最后的结果判读也简单客观，又因为其检测灵敏、准确度高，所以对于数字PCR方法检测出的阳性和阴性结果的样本，可以直接发布结果。总的来说，本发明的试剂盒检测效果良好，易于推广，具有很好的应用前景。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。