一种细菌耐氯性的评估方法

摘要

本发明公开了一种细菌耐氯性的评估方法，包括采用贫营养驯化技术对菌株进行处理，然后对驯养后的菌液计数、稀释、消毒，通过测定不同作用时间点的消毒剂余量以及细菌存活数量，通过消毒公式计算细菌灭活率为99％的CT值，并与参照菌株大肠埃希氏菌CT值大小比较，实现对试验菌株的耐氯性评价。本发明包含菌株的复苏、驯养、菌液的制备以及消毒实验参数的设计和标准的实验流程，量化了实际水体中细菌的耐氯能力，为饮用水的微生物安全评估以及耐氯微生物风险控制提供更准确的理论依据，为水厂消毒工艺的改进提供支撑，从而更好的保证饮用水的生物安全性。

说明书

技术领域

本发明涉及一种细菌耐氯性的评估方法，尤其是针对水系统中分离的耐氯菌。

背景技术

消毒剂的使用已有相当长的历史，正如细菌对抗生素的耐药性一样，长时间接触同一种(类)消毒剂的细菌会对该类消毒剂产生抵抗力，即产生抗性。随着人类社会的发展以及人们健康意识的不断增强，消毒用品的使用越来越广泛，细菌对消毒剂的抗性问题也就越加严重，这已引起人们的广泛关注与重视。目前人们对消毒剂抗性还没有一个统一的定义，其中最能被人们接受的是Russell等就细菌对消毒剂的抗性判断标准所作的描述，即细菌消毒剂抗性是指对消毒剂的常用浓度不再敏感的菌株的出现，也指那些在能杀灭或抑制大部分该种细菌的消毒剂浓度下，不能被杀灭或抑制的菌株的出现，这种现象称为细菌对消毒剂有一定的耐受性，即消毒剂抗性。细菌对消毒剂抗性的产生不仅会使消毒剂的消毒效果削减甚至失效，从而使国民经济蒙受巨大损失,而且还会严重影响人类健康。

由于氯的消毒效率高、稳定性好、易于使用、成本低廉等优势，氯仍然是全世界使用最广泛的消毒剂。某些细菌可以在含有一定余氯浓度的净水厂、供水管网中存活，这些对氯具有耐受性的细菌就可以称作“耐氯菌”(chlorine-resistant bacteria)。Langsrud等人对耐氯菌作了一个相对更理论化的定义，如果某个(或某种)微生物能够比其他微生物在更高的氯消毒剂中存活或生长，这就说明该微生物具有更高的耐氯性，可以称为耐氯菌。然而，因为消毒效率跟测试的条件、方法密切相关，因此，在科学的范畴上，耐氯菌的耐受性只是一个相对的概念，并不是一个准确的术语。

由于细菌生存环境以及自身生理结构的差异性，都可能影响其耐氯性，针对供水管网中普遍存在的耐氯菌问题，有必要分析测定不同细菌的灭活特性，进而实现对细菌耐氯性的评估，为供水水厂消毒技术的优选及耐氯菌的控制提供理论支撑及可行性建议。

发明内容

在进行水中分离到的耐氯菌耐氯性研究的过程中发现，细菌经过多次传代培养后其耐氯性出现退化的现象，实验的可重复性较差，细菌的耐氯性量化评估困难等问题。

本发明的目的在于提供一种细菌耐氯性的评估方法，为供水水厂消毒技术的优选及耐氯菌的控制提供理论支撑及可行性建议。

本发明是通过以下措施实现的：本发明先对细菌进行贫营养驯化，再对驯化后的样品进行异养菌计数(HPC)，制备适宜菌浓度的污染样品，然后进行设计好的消毒实验程序，最终计算细菌被99％灭活的CT值，通过与参照菌株的CT值比较，实现对细菌耐氯性的评估。其具体技术方案如下：

一种细菌耐氯性的评估方法，包括采用贫营养驯化技术对菌株进行处理，然后对驯养后的菌液计数、稀释、消毒，通过测定不同作用时间点的消毒剂余量以及细菌存活数量，通过消毒公式计算细菌灭活率为99％的CT值，并与参照菌株大肠埃希氏菌CT值大小比较，实现对试验菌株的耐氯性评价。具体实施步骤如下：

(1)驯养：将冻存管中保存的菌液加入5mL营养肉汤中，37℃震荡培养24h，对冻存的菌株进行复苏。取1mL复苏后的菌液加入500mL灭菌的管网水中，管网水pH 7.2～7.4，置于22℃培养箱中培养7d；

(2)菌浓度计数：将驯养后的菌液进行梯度稀释，选10^-3、10^-4、10^-5稀释倍数采用营养琼脂倾注平板法对样品进行计数，37℃培养24h，计数平板上菌落数，乘以对应的稀释倍数，即为驯养后的菌液浓度；

(3)静态消毒实验：根据(2)中计数的菌液的浓度，用pH 7.2～7.4的管网水对样品进行稀释，制备成菌浓度为10⁵CFU/mL～10⁷CFU/mL的样品进行消毒实验。制备好的样品中加入相当于2.5mg/L余氯的消毒剂，分别计数消毒剂加入0min、5min、10min、20min、30min、60min、120min、240min后的细菌存活数量及消毒剂余量；

(4)CT值的计算：采用线性回归的方法计算细菌灭活率为99％CT值，计算公式为：

其中：N-反应时间为t时的细菌存活量，CFU/mL；

N₀-灭菌之前的细菌浓度，CFU/mL；

k-反应速率常数；

t—反应时间，min；

c—消毒剂浓度，mg/L；

CT值以消毒剂浓度(mg/L)和反应时间(min)的乘积表示，以CT值表示消毒剂的消毒效果，CT值越小，消毒剂的消毒效果越好。

(5)耐氯性评价：消毒过程中选大肠埃希氏菌标准菌株作为参照菌株，若待评价菌株灭活率为99％CT值小于大肠埃希氏菌菌株灭活率为99％CT值，评价为无耐氯性；若待评价菌株灭活率为99％CT值大于大肠埃希氏菌菌株灭活率为99％CT值，依据CT值的大小评价其耐氯性强弱，灭活率为99％CT值越大，其耐氯性越强。

所述的参照菌株为大肠埃希氏菌标准菌株(ATCC8739)，菌株来源为中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)。

本发明的有益效果：

本发明包含菌株的复苏、驯养、菌液的制备以及消毒实验参数的设计和标准的实验流程，量化了实际水体中细菌的耐氯能力，为饮用水的微生物安全评估以及耐氯微生物风险控制提供更准确的理论依据，为水厂消毒工艺的改进提供支撑，从而更好的保证饮用水的生物安全性。

附图说明

图1为消毒剂衰减曲线图；

图2为大肠埃希氏菌灭活特性曲线；

图3为烂泥假单胞菌灭活特性曲线；

图4为土地戈登氏菌灭活特性曲线；

图5为烂泥假单胞菌灭活率与CT值拟合曲线。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明进行进一步的阐述，但下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

实施例1

以大肠埃希氏菌(Escherichia coli)为参照菌株，测定其被2.5mg/L的余氯灭活99％CT值的情况：

将冻存管中保存的大肠埃希氏菌(ATCC8739，菌株来源为中国工业微生物菌种保藏管理中心CICC)加入5mL营养肉汤中，37℃震荡培养24h，对冻存的菌株进行复苏。取1mL复苏后的菌液加入500mL灭菌的管网水中，置于22℃培养箱中培养7d；将驯养后的菌液进行梯度稀释，选10^-3、10^-4、10^-5稀释倍数采用营养琼脂倾注平板法对样品进行计数，37℃培养24h，计数平板上菌落数，乘以对应的稀释倍数，即为驯养后的菌液浓度。根据计数浓度，对样品进行稀释，制备成菌浓度为10⁵CFU/mL～10⁷CFU/mL的样品进行消毒实验。制备好的样品中加入相当于2.5mg/L余氯的消毒剂，分别计数消毒剂加入0min、5min、10min、20min、30min、60min、120min、240min后的细菌存活数量及消毒剂余量，大肠埃希氏菌灭活特性曲线见图2；利用公式1采用线性回归的方法计算大肠埃希氏菌(Escherichia>

实施例2

以某水厂生物砂中分离到的烂泥假单胞菌(Pseudomonas peli)为例，测定其被2.5mg/L的余氯灭活99％CT值，评价其耐氯性：

将冻存管中保存的烂泥假单胞菌(Pseudomonas peli)加入5mL营养肉汤中，37℃震荡培养24h，对冻存的菌株进行复苏。取1mL复苏后的菌液加入500mL灭菌的管网水中，置于22℃培养箱中培养7d；将驯养后的菌液进行梯度稀释，选10^-3、10^-4、10^-5稀释倍数采用营养琼脂倾注平板法对样品进行计数，37℃培养24h，计数平板上菌落数，乘以对应的稀释倍数，即为驯养后的菌液浓度。根据计数浓度，对样品进行稀释，制备成菌浓度为10⁵CFU/mL～10⁷CFU/mL的样品进行消毒实验。制备好的样品中加入相当于2.5mg/L余氯的消毒剂，分别计数消毒剂加入0min、5min、10min、20min、30min、60min、120min、240min后的细菌存活数量及消毒剂余量；利用公式1采用线性回归的方法计算细菌灭活率为99％的CT值为：36.3mg·min/L。

烂泥假单胞菌拟合消毒曲线所需数据见表1，图1所示为消毒剂衰减曲线、图3所示为灭活特性曲线、图5所示为为烂泥假单胞菌灭活率与CT值拟合曲线。

由计算可知，烂泥假单胞菌(Pseudomonas peli)灭活99％的CT值大于大肠埃希氏菌灭活99％的CT值，有一定的耐氯性。

表1烂泥假单胞菌拟合曲线所需数据

时间t(min)余氯c(mg/L)CT(mg·min/L)ln(N/N₀)51.256.25-2.45101.111-2.75200.5911.8-3.11300.618-2.96600.7746.2-4.831200.5768.4-8.952400.48115.2-8.68

实施例3

以某管网水中分离到的土地戈登氏菌(Gordonia terrae)为例，测定其被2.5mg/L的余氯灭活99％CT值，评价其耐氯性：

将冻存管中保存的土地戈登氏菌(Gordonia terrae)加入5mL营养肉汤中，37℃震荡培养24h，对冻存的菌株进行复苏。取1mL复苏后的菌液加入500mL灭菌的管网水中，置于22℃培养箱中培养7d；将驯养后的菌液进行梯度稀释，选10^-3、10^-4、10^-5稀释倍数采用营养琼脂倾注平板法对样品进行计数，37℃培养24h，计数平板上菌落数，乘以对应的稀释倍数，即为驯养后的菌液浓度。根据计数浓度，对样品进行稀释，制备成菌浓度为10⁵CFU/mL～10⁷CFU/mL的样品进行消毒实验。制备好的样品中加入相当于2.5mg/L余氯的消毒剂，分别计数消毒剂加入0min、5min、10min、20min、30min、60min、120min、240min后的细菌存活数量及消毒剂余量；利用公式1采用线性回归的方法计算细菌灭活率为99％的CT值为：551mg·min/L。

土地戈登氏菌(Gordonia terrae)消毒剂衰减曲线见图1，灭活特性曲线见图4。

由计算可知，土地戈登氏菌(Gordonia terrae)灭活99％的CT值大于大肠埃希氏菌灭活99％的CT值，有耐氯性，且其耐氯性大于烂泥假单胞菌。