RHAU基因在制备肺鳞癌辅助诊断与预后判断工具中的应用

摘要

本发明目的在于提供RHAU基因在制备肺鳞癌辅助诊断与预后判断工具中的应用。本发明提供的RHAU基因或其片段作为与肺鳞癌辅助诊断与预后判断相关的生物标志物，只在肺鳞癌中高表达，而在肺腺癌中没有差异，相较于传统的肿瘤标志物，RHAU作为新型的生物标志物，特异性高的特点，运用qRT‑PCR技术检测具有灵敏性高的特点。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程及肿瘤学领域，具体涉及RHAU基因在制备肺鳞癌辅助诊断与预后判断工具中的应用。

背景技术

肺癌是全球范围内死亡率最高的肿瘤，每年约有160万人死于肺癌，是危害生命健康的重大公共卫生问题。据世界卫生组织统计，预计到2025年，我国肺癌患者年死亡率将达到 100万，成为世界第一肺癌大国。非小细胞肺癌约占每年新诊断肺癌的85％，其组织学类型主要包括肺腺癌(50％)和肺鳞癌(30％)。随着驱动基因的发现及其靶向抑制剂的临床应用，如表皮生长因子受体(EGFR)和间变性淋巴瘤激酶(ALK)融合基因等，肺腺癌的个体化治疗取得了显著的进展。但迄今肺鳞癌尚无有效的应用于临床的分子靶向药物。肺鳞癌的治疗仍是手术和以铂类为基础的化疗，患者的5年生存率仍徘徊在15％。因此，寻找和鉴定出和肺鳞癌相关的基因，将有利于该疾病的早期筛查和诊断，及时控制病程的进展。

RHAU，又名DHX36和G4R1,是筛选AREs(AU rich elements)结合蛋白时发现的一个蛋白。它最初被确定为一个与尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)mRNA的AU-rich元件(ARE)相关联RNA解旋酶。进一步的研究发现，RHAU还可以结合到RNA和DNA的G4结构上并且解开其G4结构。近年来研究表明，G4(G-quadruplex)结构是具有潜在癌症靶标作用的 DNA/RNA二级结构，很有希望成为抗癌药物开发的重要靶点。前人研究表明，在小鼠心脏发育过程中，RHAU调控了心肌细胞的增殖。RHAU在雄性小鼠的生殖细胞中特异性地敲除后，小鼠生殖细胞的增殖显著降低，凋亡显著增加。在造血系统中特异性敲除RHAU后造成血球祖细胞增殖障碍。因此，RHAU可能是一个细胞增殖相关基因。在肿瘤研究领域，有文献报道，RHAU在乳腺癌细胞株中表达上调。RHAU可以与癌症相关基因PITX1 3’UTR结合调控其翻译。在肠癌细胞中紫外线照射引起DNA损伤的情况下，RHAU可紫外线依赖地结合到p53 pre-mRNA的3’端，促进p53 pre-mRNA的3’端的加工。这提示我们RHAU可能是肿瘤增殖的重要调节因子。

肺鳞癌作为一种至今无治疗进展的癌症，RHAU与肺鳞癌相关的研究尚未见报道。因此，开展RHAU表达水平与肺鳞癌发展相关性的研究，对于用于肺鳞癌的早期筛查和诊断，具有重大的实际意义。

发明内容

本发明的第一方面在于提供一种与肺鳞癌辅助诊断与预后判断相关的生物标志物。

本发明的第二方面在于提供检测RHAU基因或其片段表达的产品在制备诊断肺鳞癌的工具中的应用。

本发明的第三方面在于提供用于肺鳞癌辅助诊断和治疗的工具。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：

本发明的第一方面提供了一种应用于肺鳞癌辅助诊断与预后判断的生物标志物，所述生物标志物为人RHAU基因或其片段。

在一种具体实施方式中，本发明RHAU基因的片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明的第二方面提供了检测RHAU基因或其片段表达的产品在制备诊断肺鳞癌的产品中的应用。

在一种具体实施方式中，本发明RHAU基因的片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明所述的诊断肺鳞癌的产品包括但不限于通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交、芯片、或高通量测序平台检测RHAU基因或其片段的表达水平以诊断肺鳞癌的产品。

进一步的，所述用RT-PCR诊断肺鳞癌的产品至少包括一对特异扩增RHAU基因或其片段的引物；所述用实时定量PCR诊断肺鳞癌的产品至少包括一对特异扩增RHAU基因或其片段的引物；所述用免疫检测诊断肺鳞癌的产品包括：与RHAU基因或其片段表达的蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断肺鳞癌的产品包括：与RHAU基因或其片段的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断肺鳞癌的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与RHAU基因或其片段表达的蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与RHAU基因或其片段的核酸序列杂交的探针。

在一种具体的实施例中，本发明所述的产品为通过实时定量PCR检测RHAU基因或其片段的表达水平以诊断肺鳞癌的产品。

在一种具体的实施例中，用实时定量PCR诊断肺鳞癌的产品至少包括一对针对RHAU基因或其片段的特异性引物对；优选的，特异性引物对的上游引物序列如SEQ ID NO:2所示，下游引物序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明的第三方面提供了一种用于诊断肺鳞癌的工具，所述工具能够通过检测样本中的 RHAU基因或其片段的表达来诊断肺鳞癌。

在一种具体实施方式中，本发明RHAU基因的片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明所述的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸或高通量测序平台。

本发明提供了上述基因标志物及其引物在制备肺鳞癌辅助诊断与预后判断试剂盒以及在制备治疗肺鳞癌的药物中的应用。

本发明所述的试剂盒可以包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测RHAU基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括RHAU蛋白的特异性抗体。

在一种具体的实施方式中，本发明所述试剂盒至少包括用于扩增RHAU基因或其片段的特异性引物对。

进一步地，所述的特异性引物对的上游引物序列如SEQ ID NO:2所示，下游引物序列如 SEQ ID NO:3所示。

进一步地，所述的试剂盒还包括用于扩增内参肌动蛋白基因β-actin的特异性引物对，所述特异性引物对的上游引物序列如SEQ ID NO:4所示，下游引物序列如SEQ ID NO:5所示。

本发明的第四方面在于提供用于肺鳞癌辅助诊断和治疗的试剂盒及药物。

所述试剂盒在制备非小细胞肺癌筛查检测产品中应用具体包括如下步骤：

具体地说，本发明解决问题的技术方案包括：(1)建立统一标准的标本库和数据库：以标准操作程序(SOP)采集符合标准的组织样本，系统收集完整的人口学资料和临床资料。研究样本选择：初治、未行手术以及放化疗干预且经病理确认为肺鳞癌的患者。(2)采集受试者的癌和正常癌旁组织样品，利用TRIZOL试剂提取待测组织样品的总RNA；将提取的待测组织样品总RNA反转录为cDNA；实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析RHAU在癌和正常癌旁组织样品中RHAU的mRNA表达水平变化(3)分析不同时期的肺鳞癌患者中RHAU的表达，明确这些mRNA诊断肺鳞癌的能力。(4)RHAU诊断试剂盒的研制：根据肺鳞癌患者癌与正常癌旁组织中RHAU的差异表达开发RHAU诊断试剂盒。(5)分析RHAU在肺鳞癌细胞中的作用，揭示RHAU与肺鳞癌的关系，为将来研制RHAU相关治疗肺鳞癌的药物提供依据。

(1)研究样本选择：初治、未行手术以及放化疗干预且经病理确认为肺鳞癌的患者。利用TRIZOL试剂提取肺鳞癌和正常癌旁组织中的RNA，将提取的待测组织样品总RNA反转录为cDNA；通过qRT-PCR的方法，检测RHAU在组织中的表达差异。

(2)利用引物进行实时荧光定量PCR检测RHAU基因片段的表达水平，对扩增产物定量和均一化后，进行数据分析；计算所述RHAU基因片段的Ct与内参肌动蛋白基因的Ct 值之差ΔΔCt，根据ΔΔCt计算RHAU基因的相对表达量。

(3)采用群体测定值分布比较法，将步骤(2)中所述RHAU基因片段的相对表达量与对应患者人群的测量中间值进行比较，若所述RHAU基因的相对表达量高于所述测量中间值，则预示肺鳞癌癌变的风险较高。

本发明的有益效果：

1.RHAU基因只在肺鳞癌中高表达，而在肺腺癌中没有差异。相较于传统的肿瘤标志物， RHAU作为新型的生物标志物，特异性高的特点，运用qRT-PCR技术检测具有灵敏性高的特点。

2.研究者通过qRT-PCR，western blot，免疫组织化学染色(IHC)的多种定量方法，对肺鳞癌患者癌和正常癌旁组织中的RHAU表达进行严密的验证和评价。证实了RHAU作为诊断肺鳞癌的标记物的可靠性以及可重复性。

3.通过拷贝数检测，发现了RHAU在肺鳞癌组织中有拷贝数增加的情况。

4.通过共享数据库分析，证实了RHAU高表达与患者预后差显著相关，为肺鳞癌的预后判断提供了可靠的理论支持。

附图说明

图1为qRT-PCR检测RHAU在肺腺癌和肺鳞癌组织及正常癌旁组织中表达水平。

图2为Western blot检测RHAU在肺鳞癌组织及正常癌旁组织中表达水平。

图3为IHC检测RHAU在肺鳞癌组织及正常癌旁组织中表达水平。

图4为RHAU在肺鳞癌组织中的拷贝数变化统计。

图5为RHAU表达水平与肺腺癌和肺鳞癌患者预后生存率之间的关系。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例，如无特殊说明，下列实施例中所用的试剂为常规市面购买试剂；如无特殊说明，下述实施例中所用的方法为本领域的常规方法。

实施例1：qRT-PCR检测RHAU在肺癌组织中的mRNA表达水平

本实施例提取肺腺癌，肺鳞癌组织和正常癌旁组织总RNA，通过qRT-PCR分别扩增RHAU片段基因(序列如SEQ ID NO:1所示)和内参基因β-actin，分析RHAU基因在两种癌组织和正常癌旁组织中的表达差异。具体方法包括如下步骤：

(1)癌组织及正常癌旁组织样本采集：本实施例具体以20例肺腺癌，40例肺鳞癌患者为研究对象，取癌组织和正常癌旁组织，60例肺癌病人样本采自南京市胸科医院；本实验内容是经过南京市胸科医院医学伦理委员会批准，所有病例都得到了患者的知情同意。

(2)提取待测癌组织和正常癌旁组织总RNA：将收集的组织样品，加入Trizol(Invitrogen)室温放置5min，使细胞充分裂解；按照0.2mL/mL Trizol加入氯仿，震荡混匀，室温放置15min；4℃，12 000×g离心15min，将上层水相转移至无RNase的离心管中；按0.5mL/mL Trizol加入异丙醇，室温静置5～10min；4℃，12 000×g离心10min，按1mL 75％乙醇/mL Trizol加入75％乙醇，温和震荡悬浮沉淀，4℃，8 000×g离心5min，弃上清，室温晾干5～10min，加入50μL无RNase的水，用枪头洗打，使沉淀充分溶解；利用NanoDrop 2000测定总RNA的浓度以及总RNA的质量。

(3)将上述提取的总RNA反转录为cDNA：在一个无RNase的离心管中加入1μg的总RNA，70℃孵育10min变性后，将离心管迅速放置在冰上；在含有变性RNA的离心管中配置如下反应体系：4μL的25mM MgCl₂；2μL的10×reaction>

(4)qRT-PCR检测RHAU基因的表达水平：以上述提取反转录的cDNA为模版，利用表1中的引物进行实时荧光定量PCR扩增RHAU基因片段和内参基因β-actin片段，计算所述RHAU基因片段的Ct与内参β-actin基因的Ct值之差ΔΔCt，根据ΔΔCt值定量分析RHAU 基因在NSCLC癌组织和正常癌旁组织中的表达水平差异；上述qRT-PCR反应体系如下：包含2μLcDNA模板，10pmol/L的上、下游引物各0.1μL，2×SYBR Green qPCR Mix 5μL，去离子水2.8μL；进行实时荧光定量PCR所用的反应程序为：预变性95℃20s5min；扩增反应：95℃变性10s，60℃退火30s，40个循环；绘制溶解曲线：95℃15s，60℃1min， 95℃15s。

表1各引物的核苷酸序列

本实施例通过graphpad 6.0分析肺腺癌组织和正常癌旁组织以及肺鳞癌组织和正常癌旁组织中RHAU基因片段表达水平的差异，结果如图1所示，从图1可以看出：与正常癌旁组织相比，在肺鳞癌组织中RHAU基因片段的表达水平具有显著性增加(图1B)，而在肺腺癌组织没有显著差异(图1A)。

实施例2：Western blot检测蛋白表达水平

将细胞按1×10⁶个/孔铺到6孔板中，24h后生长至70-80％的汇合度，刮取细胞，用蛋白裂解液裂解细胞，置于冰上裂解20min，然后4℃，12,000rpm离心15min，取上清稀释后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，并转膜到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上(Millipore公司)，并用5％脱脂牛奶室温进行封闭1h，然后用兔抗人RHAU多克隆抗体(ProteinTech公司，1:1000稀释)，鼠抗人β-actin单克隆抗体(美国Abcam公司，1:200稀释)作为内参，4℃，孵育过夜。TBST>

如图2所示(N代表正常癌旁组织(Normal)，T代表癌组织(Tumor))，与正常癌旁组织相比，RHAU在肺鳞癌组织中的蛋白质表达水平明显上升。

实施例3：IHC检测蛋白表达水平

取5例肺鳞癌患者的癌和癌旁组织的石蜡切片，脱蜡至水，用pH7.4的PBS冲洗三次，每次3min(3×3min)；用pH＝6.0柠檬酸盐缓冲液抗原修复，取出微波盒自然泠却，从缓冲液中取出玻片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用PBS冲洗2×3min；每张切片加1滴3％H2O2，室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3×3min；除去PBS液，每张切片加1滴相应的第一抗体(Proteintech公司，1：100稀释)，4℃，孵育过夜；PBS冲洗3×5min，除去PBS液，每张切片加1滴聚合物增强剂，室温下孵育20分钟，PBS冲洗 3×3min；除去PBS液，每张切片加1滴酶标抗兔聚合物，室温下孵育30分钟。PBS冲洗3 ×5min；除去PBS液，每张切片加1滴新鲜配制的DAB液，显微镜下观察5分钟；苏木素复染，0.1％HCl分化，自来水冲洗，蓝化，切片经梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固，晾干后观察。

如图3所示(N代表正常癌旁组织(Normal)，T代表癌组织(Tumor))，与正常癌旁组织相比，RHAU在肺鳞癌组织中的蛋白质表达水平明显上升。

实施例4：qRT-PCR检测RHAU在肺鳞癌组织中的拷贝数变化情况。

提取待测癌组织和正常癌旁组织总DNA(Vazyme公司试剂盒)，利用表2中的引物进行实时荧光定量PCR扩增RHAU基因片段和内参基因β-actin和line-1片段，计算所述RHAU基因片段的Ct与内参基因β-actin和line-1的Ct值之差ΔΔCt，根据ΔΔCt值定量分析RHAU 基因在肺鳞癌癌组织和正常癌旁组织中的拷贝数变化；上述qRT-PCR反应体系如下：包含 DNA模板(2μL,35ng用于RHAU和β-actin扩增，10ng用于line-1扩增)，10pmol/L的上、下游引物各0.1μL，2×SYBR Green qPCR Mix 5μL，去离子水2.8μL；进行实时荧光定量PCR所用的反应程序为：预变性95℃20s5min；扩增反应：95℃变性10s，60℃退火30s， 40个循环；绘制溶解曲线：95℃15s，60℃1min，95℃15s。

如图4所示，与正常癌旁组织相比，51.5％的肺鳞癌组织有RHAU基因拷贝数扩增。

表2各引物的核苷酸序列

实施例5：评估RHAU基因片段的表达水平与肺鳞癌患者预后之间的关系

为了评估RHAU表达水平与肺鳞癌患者预后之间的关系，我们通过在线工具(http://kmplot.com)进行了Kaplan-Meier生存分析，对包含约141例肺鳞癌患者的队列分析显示(图5B)，高RHAU基因片段表达水平与无进展期生存率降低相关(HR＝2.07,log-rankP ＝0.006)。同时对包含341例肺腺癌患者的队列分析显示(图5A)，高RHAU基因片段表达水平与患者生存率无显著关联(HR＝1.15,log-rankP＝0.39)。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。

序列表

<110> 南京市胸科医院

<120> RHAU基因在制备肺鳞癌辅助诊断与预后判断工具中的应用

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3027

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 1

atgagttatg actaccatca gaactggggc cgtgatgggg gtccccgcag ctccggtggg 60

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cgattccagg atggatatta cagctga 3027

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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<210> 3

<211> 21

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aaagccgctc aactacatgg 20

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tgctttgaat gcgtcccaga g 21