作为PARP抑制剂的吡唑并喹唑啉酮衍生物及其用途

摘要

本发明公开了一种作为聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）抑制剂的吡唑并喹唑啉酮衍生物及其用途。作为PARP抑制剂的吡唑并喹唑啉酮衍生物为具有式（I）所示化合物或其药学上可接受的盐。该化合物能够用作PARP抑制剂，对PARP‑1具有良好的抑制活性，可作为选择性抑制剂预防和治疗与PARP相关的疾病。该化合物还具有穿透血脑屏障的良好特性，在脑肿瘤以及其它肿瘤脑部转移的预防和治疗中有良好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一系列作为PARP抑制剂的吡唑并喹唑啉酮衍生物及其用途。

背景技术

聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(Poly ADP-ribose Polymerase, PARP)存在于哺乳动物细胞和大多数真核细胞中，是一类催化聚ADP核糖化的细胞核酶，能够识别DNA单链断点启动修复，是重要的DNA修复酶，在DNA修复通路中起关键作用。在各类DNA损伤中，DNA单链损伤发生最为频繁，而其一系列的修复途径所采用的酶就是PARP。DNA损伤断裂时会激活PARP，它作为DNA损伤的一种分子感受器，具有识别、结合到DNA断裂位置的功能，使其催化活性提高10-500倍，进而激活、催化受体蛋白的聚ADP核糖基化作用，参与DNA的修复过程。

PARP利用二磷酸腺苷核糖，以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）为底物，对靶标蛋白进行翻译后修饰-多聚ADP核糖基化，进而调控细胞的生理功能(Burkle,>+向目标蛋白分子上添加多聚（ADP-核糖），是修复DNA过程的重要组成部分。这个过程对保持DNA及染色体的完整和稳定至关重要，是保证哺乳类细胞存活的重要保障。

PARP家族共包含17个成员，仅PARP-1和PARP-2涉及DNA单链断裂的修复。其中PARP-1在真核细胞内含量最高。细胞内的绝大多数ADP核糖聚合活力均是由PARP-1催化而成。在细胞内，PARP-1通过碱基切除的方式修复DNA断链，在调节DNA的损伤修复中扮演重要角色。敲除PARP-1的小鼠不具备单链DNA损伤修复功能（Krishnakumar and Kraus,2010, Molecular Cell, 39:8)。

在PARP家族中，PARP-2和PARP-1的同源性最高(Kutuzov, M. M. et al. Molecular Biology, 48，485-495)。在生物学功能上，它和PARP-1既有相似之处，又有不同。和PARP-1一样，PARP-2也可以被损伤的DNA激活(Ame, J.C. et al. JBC 1999, 274， 17860-8)。对PARP-2基因敲除模型的研究发现，模型小鼠对电离辐射、甲基化试剂的敏感性升高，基因组的不稳定性增加。另外，PARP-2还具有独特的生理功能。对PARP-2基因进行下调，会阻止心肌细胞肥大（Geng, B. et al. Biochemical and Biophysical Research Communications, 430, 944-950）。在结肠炎小鼠模型中，对PARP-2基因进行敲除会改善炎症状况，并促进结肠功能的恢复(Popoff, I. et al. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 2002,303, 1145-1154)。

在已知的PARP相关的功能中，PARP-1占主导地位，具体包括（1）修复DNA和维持基因组稳定性；（2）调节转录水平，调控有关蛋白的表达；（3）影响复制和分化，参与维持端粒长度；（4）调控细胞死亡及清除机体内部受损细胞。而大部分与PARP活性相关的DNA损伤(>90%)均由PARP-1负责。PARP-1介导的DNA修复起着多重分子生物学效应：一方面PARP能修复因氧化或化疗药物引起的DNA受损，是导致化疗或放疗耐药的重要因素；另一方面，按照合成致死理论，两个基因之间若存在合成致死作用，当其中任何一个基因单独受到抑制或发生突变时，细胞的生存不受影响，但同时抑制两个基因将导致细胞凋亡（Kraus W. L. and Lis, J. T.2003. Cell 113: 677-683 ; Ame , J. C. C. Spenlehauer, and G. de Murcia . Bioessays 26：882-93)。PARP-1/2被召集至DNA损伤位点，并且在通过其锌指进行DNA结合后活化，然后在组蛋白谷氨酸残基上聚（ADP-核糖）化。这生成高度带负电的ADP-核糖链、其依次导致通过碱基切除修复机制使损伤DNA解旋和修复。

已有研究证实，PARP-1抑制剂与放化疗联合应用可以有效增强抗肿瘤临床效果(Plummer R, Jones C, et al. Clin Cancer Res. 2008 Dec 1; 14 (23)：7917—23)。放射和化疗是用于癌症治疗的两种重要治疗方法。现有的化疗药物和放疗均是直接或间接攻击DNA，造成DNA损伤，通过DNA单链断裂的机制杀死癌细胞。然而，在肿瘤细胞中DNA修复酶过度表达会激活自身的DNA损伤修复机制，通过单链断裂激活PARP-1并且启动碱基切除修复机制以修复损伤，进而在药物治疗和放疗过程中产生抗性。而当PARP-1活性被抑制时，单链DNA变得持久，其导致基因组异常和凋亡，最终细胞死亡（Dantzer, F., G. de La Rubia, et al. Biochemistry 2000;39:7559-69）。因此抑制PARP-1的活性能有效阻滞损伤DNA的修复，降低肿瘤细胞的自我修复能力，从而与化疗药物产生协同抗肿瘤作用。

同时，具有DNA修复缺失功能的癌细胞，例如BRCA1(乳腺癌1)或BRCA2(乳腺癌2）、缺失型癌细胞，对导致DNA损伤的抗癌化疗药物（包括含铂类化疗药物、DNA甲基化类抗癌化疗药物和DNA拓扑异构酶抑制剂类等）和放射治疗都格外敏感。临床二期试验数据显示PARP-1抑制剂奥拉帕尼(Olaparib,AZD2281)用于治疗晚期乳腺癌是有效的（Andrew Tutt et al.,2009,J. Clin. Oncol 27：18s, Andrew Tutt et al. , 2010 Lancet 376：235;RA Dent et al. 2010 J. Clin. Oncol. 28:15s)。

因此，通过抑制PARP-1的活性可抑制PARP-1介导的DNA修复机制，提高放疗和化疗对肿瘤细胞DNA的损伤，因而对肿瘤有治疗作用。用PARP-1抑制剂来治疗癌症主要基于两种机制：其一，由于快速增长，癌症细胞DNA复制远远高于正常细胞，因此能导致DNA损伤的药物会有选择地造成癌细胞的死亡，但由于DNA修复酶如PARP-1的存在，这类药物的药性不能充分发挥，因此PARP-1抑制剂与常用的DNA损伤类化疗抗癌药物结合使用，由于其对DNA修复的抑制，极大地放大了DNA损伤类抗癌药物，比如替莫唑胺(temozolomide)的药性，从而产生协同效应；其二，对有DNA修复缺陷的癌细胞，比如乳腺癌易感基因（BRCA1、BRCA2)缺失的三阴性乳腺癌等癌细胞，PARP-1抑制剂能独立地作为抗癌药物，直接杀死这些细胞。乳腺癌和卵巢癌是造成女性死亡的主要疾病。乳腺癌中BRCA1或BRCA2突变占全部乳腺癌的3-5%，在卵巢癌中占比达5%以上(R. Wooster and B. L. Weber (2003). N. Engl. J. Med. 348 (23): 2339-2347)。三阴性乳腺癌是指缺乏雌激素以及孕激素受体、也不表达人表皮生长因子受体-2（HER2）的乳腺癌，这类患者约占了全部乳腺癌的15%，对目前的雌激素治疗以及人表皮生长因子受体-2（HER2）靶向治疗均无反应，尚无标准治疗方案。DNA单链损伤可在DNA复制形成复制叉过程中转变为双链损伤(DSB)，而双链损伤(DSB)仍可通过同源重组(HR)途径修复完成。如果肿瘤细胞存在同源重组修复缺陷(包括BRCA1和BRCA2突变)，使得双链损伤(DSB)损伤无法修复，则会导致PARP抑制剂和同源重组修复缺陷对肿瘤细胞合成致死的作用。因此BRCA1/2在同源重组(HR)机制进行的DNA双链断裂修复中起着不可或缺的作用。BRCA1/2基因缺陷细胞不能修复DNA双链断裂，而主要依赖于PARP-1/2介导的碱基切除修复，以保持遗传完整性。PARP-1活性的抑制导致BRCA1/2基因缺陷癌细胞的合成致死性（Bryant, H.E.,N. Schultz, H.D.Thomas, et al. (2005).《自然（Nature.）》434:913-917)。BRCA1和BRCA2只是同源重组(HR)修复的一部分，其他蛋白如EMSY和PTEN对于同源重组(HR)途径同样重要，如果同源重组(HR)修复途径中这些基因突变或表达沉默，PARP抑制剂即可能通过合成致死作用而产生单药抗肿瘤活性。因此，PARP-1抑制剂可通过缺陷性DNA修复机制作为癌症治疗的单一药剂，可用于有选择地有效地治疗有遗传性DNA修复缺陷的癌症，包括三阴性乳腺癌。

另外，虽然PARP具有DNA修复功能，但是当DNA的损伤过度难以被修复时，PARP被过度激活，倾向于一种“自杀机制”而大量消耗底物NAD⁺和ATP，使细胞能量耗竭，导致细胞坏死，最终引起器官组织的损伤，这是脑损伤以及神经退行性疾病的发病机制之一。研究表明PARP-1抑制剂在脑缺血性损伤、休克、阿尔茨海默病和帕金森病等疾病的动物模型中均显示出较好的效果。因此，PARP-1抑制剂也可用于治疗因细胞过度死亡引起的疾病，包括各种缺血性疾病，如中风和神经退行性疾病等中枢神经系统疾病（Akinori>

综上所述，PARP-1抑制剂能用作抗癌药物有效地治疗多种癌症，是近年来肿瘤治疗领域的热门靶点，在抗肿瘤方面具有广阔的研究和应用前景。PARP抑制剂理论上不仅是化疗、放疗的增敏剂，对于那些基因突变（BRCA1/2突变)或HR缺陷的肿瘤更为敏感，也可单独用于BRCA突变肿瘤的治疗(Bryant, H. E. et al. Nature, 2005, 434, 913-7)。虽然PARP抑制剂通常与BRCA1或BRCA2种系基因突变联系在一起，但有望拓展到其他原因导致的HR缺陷肿瘤中；同时PARP抑制剂也是治疗卵巢癌最有希望的靶向药物。目前已有多个选择性PARP-1/2抑制剂成功上市，且有更多PARP抑制剂正在临床研发中，这些药物的临床评价包括乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、结直肠癌、胰腺癌、肝癌、黑色素瘤、胃癌和实体瘤等。此外，由于其多功能作用，PARP-1/2抑制剂还可用于治疗多种人类疾病，如中风、心肌梗塞、炎症、高血压、动脉粥样硬化和糖尿病。

PARP-1抑制剂的活性可用PARP-1酶直接测定。同时，因为PARP-1抑制剂能增加DNA损伤类化疗抗癌药物例如甲磺酸甲酯（MMS）对癌细胞的细胞毒性，抑制剂的活性也可用DNA损伤类抗癌药，例如甲磺酸甲酯（MMS），在PARP-1抑制剂的存在下，对癌细胞的细胞毒性实验MTT（3-（4,5-二甲基-2-噻唑）-2,5-二苯基溴化四氮唑噻唑蓝）法测定。此外，PARP-1抑制剂单独使用可以杀死有DNA修复缺陷，如BRCA1或BRCA2基因缺失，三阴性乳腺癌的肿瘤细胞。因此，PARP-1抑制剂的抗癌活性，可以通过这些化合物对BRCA-2缺失的Capan-1人胰腺癌细胞生长的抑制效果来测定。

已知许多抗癌药物可诱导癌细胞凋亡。细胞凋亡机制包括一系列凋亡蛋白酶的激活。凋亡蛋白酶是一组需要底物的P1位置为天门冬氨酸残基才能有效水解的半胱氨酸蛋白酶家族。其中凋亡蛋白酶-3，-6和-7是关键的凋亡蛋白酶，它们能切割多种细胞中的蛋白质底物，导致细胞凋亡。细胞内的凋亡蛋白酶活性可采用荧光标记的底物来测量，用于检测细胞凋亡。PARP-1抑制剂能增加DNA损伤类化疗抗癌药物例如MMS的诱导细胞凋亡作用。因此PARP-1抑制剂的活性也可用DNA损伤类化疗抗癌药物与PARP-1抑制剂共用在癌细胞内诱导的凋亡蛋白酶活力实验来测定。

现有技术中，专利文件（CN101506214）公开了一类吡唑并喹唑啉酮化合物，该化合物的大多数分子对PARP-1抑制活性Ki大于200 nM，部分甚至超过9500 nM。专利文件（WO2007144669）公开了一类吡唑并喹唑啉酮化合物，该公开专利声称对PARP-1抑制活性IC50小于10 μM，但未给出具体数据。本发明公开化合物活性远远强于上述专利公开化合物的活性。

另外，颅内肿瘤统称为脑瘤，因其特殊的解剖位置关系和血脑屏障（blood brain barrier，BBB）的影响，治疗有其自身的特点。血脑屏障是指脑毛细血管壁与神经胶质细胞形成的血浆与脑细胞之间的屏障和由脉络丛形成的血浆和脑脊液之间的屏障，可限制给药效率，使通常的药物难以对脑瘤起效。因此，研发可穿透血脑屏障的抗癌药具有重要意义。本发明公开化合物具有很好的血脑屏障通透性，对脑瘤治疗具有重要应用价值。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种具有良好生物学活性的吡唑并喹唑啉酮衍生物或其药学上可接受的盐，其作为PARP抑制剂可用于疾病的预防和治疗。

为了达到上述目的，本发明提供了一种吡唑并喹唑啉酮衍生物，其为具有式（I）所示化合物或其药学上可接受的盐。

本发明化合物含有碱性基团可与酸成盐，采用通常技术可以形成所述的衍生物的盐。本发明所述的“药学上可接受的盐”可以是有机酸盐和无机酸盐等。具体的有机酸盐可列举为甲酸盐、乙酸盐、酒石酸盐、枸橼酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、草酸盐、苹果酸盐、乳酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐；与低级烷基磺酸，如甲磺酸、乙磺酸、三氟甲磺酸等可形成甲磺酸盐、乙磺酸盐、三氟甲磺酸盐；与芳基磺酸，如苯磺酸或对甲苯磺酸等可形成对甲苯磺酸盐、苯磺酸盐；与氨基酸，如谷氨酸或天冬氨酸可形成谷氨酸盐或天冬氨酸盐。具体的无机酸盐为氢卤酸盐（包括氢氟酸、氢溴酸、氢碘酸、氢氯酸）、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐等。

其中，

R₁代表H、C₁-C₃的烷基或C₁-C₃的烷氧基；

R₂代表H或C₁-C₄的烷基；

n选自1、2或3；

R₃和R₄分别代表氢、甲基、乙基、正丙基、环己基、烯丙基或炔丙基；或者，R₃和R₄代表R3、R4与其连接的N原子共同构成的C₃-C₁₀的含氮杂环；

并且，所述的R1、R2、R3和R4不同时为氢。

较佳地，所述吡唑并喹唑啉酮衍生物为下列化合物之一，或其药学上可接受的盐：

。

本发明还提供了所述的吡唑并喹唑啉酮衍生物在制备用于预防和治疗与PARP相关的疾病的药物中的应用。

较佳地，所述的PARP相关的疾病包含癌症、中风、心肌梗塞、炎症、高血压、动脉粥样硬化和糖尿病。

较佳地，所述的癌症包含肺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤、黑色素瘤、肾细胞癌、结直肠癌、头颈部癌、膀胱癌、前列腺癌、肝细胞肝癌、胆管癌，以及上述肿瘤脑部转移的预防与治疗。

较佳地，所述的乳腺癌包含三阴性乳腺癌，所述的脑部肿瘤包含多形性胶质母细胞瘤。

较佳地，所述的PARP相关的疾病包含肿瘤的脑部转移。

较佳地，所述的吡唑并喹唑啉酮衍生物具有良好的血脑屏障通透性，可用于脑部肿瘤相关癌症的治疗。

较佳地，所述的吡唑并喹唑啉酮衍生物作为PARP-1抑制剂。

较佳地，所述的吡唑并喹唑啉酮衍生物可与药学上可接受的载体形成药物组合物。

本发明具有以下有益效果：本发明所提供的吡唑并喹唑啉酮衍生物对PARP-1具有显著的选择性抑制作用，具有较好的药代动力学特征，口服生物吸收度良好，具有穿透血脑屏障的良好特性，在脑肿瘤中有较好应用前景。可应用于治疗对PARP抑制作用有反应的疾病或病症的组合物或组合产品中，尤其适用于治疗肿瘤、中风、心肌梗塞、炎症、高血压、动脉粥样硬化和糖尿病。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。

本发明的化合物包括但不限于下列实施例的化合物。

合成方法：

实施例化合物按以下通用方案1制备，其中m=0~1。

第(i)步：不同取代基的关键原料SMa和SMb在酸催化下回流过夜，或进行微波反应几分钟制备不同取代基的中间体衍生物c，酸选自无机酸和有机羧酸，可以是盐酸、硫酸、乙酸，丙酸，三氟乙酸，优选为乙酸；

第(ii)步：把含不同取代基的衍生物c的酯基还原成氨基，制备含游离氨基的本发明化合物Ia，还原剂可选金属酸性体系，如Zn＋HCl，Fe＋HCl，Sn＋HCl，优选雷尼镍（Raney Ni）；

第(iii)步：用卤代烷对Ia类衍生物的游离氨基进行N-单烷基化、N-双烷基化或环合，制备N-取代的本发明化合物Ib。

关键原料SMa可通过市售购买得到，不能购买获得的可由以下通用方案2制备。起始原料s在第(iv)步中用盐酸和亚硝酸钠进行硝化生成中间体m，第(v)步中再把硝基还原成氨基生成关键原料SMa。还原剂可用SnCl₂/HCl，FeCl₃/HCl，氢气等。

关键原料SMb可通过市售购买得到，不能购买获得的可由以下通用方案3制备，其中m=0~1。起始反应物d和e在第(vi)步中，在碱性条件下低温反应缩合成关键原料SMb。碱可用BuLi、NaH、醇钠等，反应温度-78℃~60℃。

实施例1：化合物I-1的合成，按通用方案1制备，具体方法如下所示：

步骤一制备SMb1：向含乙醇钠(2.55 g，37.7 mmol)的乙醇（50 ml）溶液中加入草酸二乙酯d1(5 g)，60℃下搅拌0.5 h，将丙腈e1(3 ml)加入到混合物中并加热回流7 h。反应物冷却至室温，过滤收集固体，乙醚洗涤，自然干燥得SMb1，直接用于下一步反应。

步骤二制备c1：可由通用方法A和通用方法B制备。

通用方法A：原料SMa1溶于乙酸，加入SMb1，混和物在微波反应器中于150℃反应5-10分钟，过滤收集沉淀，乙醚洗涤，乙酸乙酯/乙醇重结晶得c1。

通用方法B：将原料SMa1和SMb1悬浮在乙醇盐酸溶液中（将HCl气体通入乙醇中），回流过夜，冷至室温，过滤收集固体，乙酸乙酯/乙醇重结晶得c1。

MS m/z (ESI): 272.1 [M+1]⁺。¹HNMR>

步骤三制备I-1：c1 (1 mmol)和雷尼镍（3 g）溶于30 ml甲醇铵中，通入氢气搅拌6 h。反应液过滤，经硅胶柱层析纯化（10%甲醇/二氯甲烷）得I-1。MS m/z (ESI): 229.1 [M+1]⁺。¹HNMR>

本发明所述的吡唑并喹唑啉酮衍生物Ib的通用制备方法：将I-1、I-21、I-23，I-27，I-37，I-38，I-39，I-40，I-41，I-42，I-43和相应卤代烷溶于乙醇中，加入乙醇钠，0℃～40℃回流搅拌6 h-24 h，回收溶剂得相应产物。

实施例2：制备I-2。

将I-1 (15 mmol)和碘甲烷（15 mmol）溶于乙醇中，加入乙醇钠，0℃～40℃搅拌6 h-10 h，回收溶剂经硅胶柱层析（乙酸乙酯：石油醚1：3）分离得I-2。MS m/z (ESI): 243.1 [M+1]⁺。¹HNMR>

实施例3：制备I-3。

同实施例2的方法，将I-1(10 mmol)和碘甲烷(30 mmol)溶于乙醇中，加入乙醇钠，回流搅拌18 h-24 h，回收溶剂经硅胶柱层析（乙酸乙酯：石油醚1：5）分离得I-3。MS m/z (ESI): 257.1 [M+1]⁺。¹HNMR>

实施例4：制备I-4。

同实施例2的方法，将I-1(10 mmol)和碘乙烷(30 mmol)溶于乙醇中，加入乙醇钠，回流搅拌18 h-24 h，回收溶剂经硅胶柱层析（乙酸乙酯：石油醚1：5）分离得I-4。MS m/z (ESI): 285.2 [M+1]⁺。¹HNMR>

实施例5：制备I-5。

同实施例2的方法，将I-1(10 mmol)和1-碘丙烷(30 mmol)溶于乙醇中，加入乙醇钠，回流搅拌18 h-24 h，回收溶剂经硅胶柱层析（乙酸乙酯：石油醚1：5）分离得I-5。MS m/z (ESI): 313.2[M+1]⁺。¹HNMR>

实施例6：制备I-6。

同实施例2的方法，将I-2(10 mmol)和2-碘丙烷(15 mmol)溶于乙醇中，加入乙醇钠，回流搅拌18 h-24 h，回收溶剂经硅胶柱层析（乙酸乙酯：石油醚1：5）分离得I-6。MS m/z (ESI): 285.2 [M+1]⁺。¹HNMR>

实施例7：制备I-7。

同实施例2的方法，将I-2(10 mmol)和碘乙烷(15 mmol)溶于乙醇中，加入乙醇钠，回流搅拌18 h-24 h，回收溶剂经硅胶柱层析（乙酸乙酯：石油醚1：5）分离得I-7。MS m/z (ESI): 271.1 [M+1]⁺。¹HNMR>

实施例8：制备I-8。

同实施例2的方法，将I-2(10 mmol)和1-碘丙烷(15 mmol)溶于乙醇中，加入乙醇钠，回流搅拌18 h-24 h，回收溶剂经硅胶柱层析（乙酸乙酯：石油醚1：5）分离得I-8。MS m/z (ESI): 285.1 [M+1]⁺。¹HNMR>

实施例9：制备I-9。

同实施例2的方法，将I-2(10 mmol)和1-溴丙烯(15 mmol)溶于乙醇中，加入乙醇钠，回流搅拌18 h-24 h，回收溶剂经硅胶柱层析（乙酸乙酯：石油醚1：5）分离得I-9。MS m/z (ESI): 283.1 [M+1]⁺。¹HNMR>

实施例10：制备I-10。

同实施例2的方法，将I-1(10 mmol)和1-溴丙烯(10 mmol)溶于乙醇中，加入乙醇钠，0℃～40℃搅拌6 h-10 h，回收溶剂经硅胶柱层析（乙酸乙酯：石油醚1：3）分离得I-10。MS m/z (ESI): 269.1 [M+1]⁺。¹HNMR>

实施例11：制备I-11。

同实施例2的方法，将I-1(10 mmol)和1-溴丙炔(10 mmol)溶于乙醇中，加入乙醇钠，0℃～40℃搅拌6 h-10 h，回收溶剂经硅胶柱层析（乙酸乙酯：石油醚1：3）分离得I-11。MS m/z (ESI): 267.1 [M+1]⁺。¹HNMR>

实施例12：制备I-12。

同实施例2的方法，将I-2(10 mmol)和1-溴丙炔(15 mmol)溶于乙醇中，加入乙醇钠，回流搅拌10 h-24 h，回收溶剂经硅胶柱层析（乙酸乙酯：石油醚1：5）分离得I-12。MS m/z (ESI): 281.1 [M+1]⁺。¹HNMR>

实施例13：制备I-13。

同实施例2的方法，将I-1(10 mmol)和碘乙烷(10 mmol)溶于乙醇中，加入乙醇钠，0℃～40℃搅拌6 h-10 h，回收溶剂经硅胶柱层析（乙酸乙酯：石油醚1：3）分离得I-13。MS m/z (ESI): 257.1 [M+1]⁺。¹HNMR>

实施例14：制备I-14。

同实施例2的方法，将I-13(10 mmol)和2-碘丙烷(15 mmol)溶于乙醇中，加入乙醇钠，回流搅拌18 h-24 h，回收溶剂经硅胶柱层析（乙酸乙酯：石油醚1：5）分离得I-14。MS m/z (ESI): 299.2 [M+1]⁺。¹HNMR>

实施例15：制备I-15。

同实施例2的方法，将I-13(10 mmol)和碘环己烷(15 mmol)溶于乙醇中，加入乙醇钠，回流搅拌18 h-24 h，回收溶剂经硅胶柱层析（乙酸乙酯：石油醚1：5）分离得I-15。MS m/z (ESI): 339.2 [M+1]⁺。¹HNMR>

实施例16：制备I-16。

同实施例2的方法，将I-1(1.07 g，4.7 mmol)和1-溴-4-氯丁烷（0.8 g，4.7 mmol）溶于3 ml乙醇中，加入乙醇钠（0.32 g，4.7 mmol）,搅拌过夜，回收溶剂经硅胶柱层析（乙酸乙酯：石油醚1：5）分离得I-16。MS m/z (ESI): 283.1 [M+1]⁺。¹HNMR>

实施例17：制备I-17。

同实施例2的方法，将I-1 (10 mmol)和1-溴-3-氯丙烷(10 mmol)溶于乙醇中，加入乙醇钠，回流搅拌16 h-24 h，回收溶剂经硅胶柱层析（乙酸乙酯：石油醚 1：5）分离得I-17。MS m/z (ESI): 269.1 [M+1]⁺。¹HNMR>

实施例18：制备I-18。

同实施例2的方法，将I-1 (10 mmol)和1-溴-5-氯戊烷(10 mmol)溶于乙醇中，加入乙醇钠，回流搅拌16 h-24 h，回收溶剂经硅胶柱层析（乙酸乙酯：石油醚 1：5）分离得I-18。MS m/z (ESI): 297.2 [M+1]⁺。¹HNMR>

实施例19：制备I-19。

同实施例2的方法，将I-1 (10 mmol)和溴代环丙烷(10 mmol)溶于乙醇中，加入乙醇钠，0℃～40℃搅拌6 h-10 h，回收溶剂经硅胶柱层析（乙酸乙酯：石油醚 1：3）分离得I-19。MS m/z (ESI): 269.1 [M+1]⁺。¹HNMR>

实施例20：制备I-20。

同实施例2的方法，将I-1 (10 mmol)和溴甲基环丙烷(10 mmol)溶于乙醇中，加入乙醇钠，0℃～40℃搅拌6 h-10 h，回收溶剂经硅胶柱层析（乙酸乙酯：石油醚 1：3）分离得I-20。MS m/z (ESI): 283.1 [M+1]⁺。¹HNMR>

实施例21：制备1-21。

步骤一：先按通用方案2制备SMa21，如下式所示。

在0-10℃下，起始原料s21（1 g，6 mmol）溶于浓盐酸（10 ml），并加入NaNO₂（0.45>2-H₂O（3>

再按实施例1方法制备I-21，步骤二中用SMa21替换SMa1制备相应中间体c21，步骤三中用c21替换c1得到I-21。MS m/z (ESI): 259.1 [M+1]⁺。¹HNMR>

实施例22：制备I-22。

同实施例3的方法，将I-21(10 mmol)和碘甲烷(30 mmol)溶于乙醇中，加入乙醇钠，回流搅拌18 h-24 h，回收溶剂经硅胶柱层析（乙酸乙酯：石油醚1：5）分离得I-22。MS m/z (ESI): 287.1 [M+1]⁺。¹HNMR>

实施例23：制备I-23。

同实施例21的方法。

步骤一：先按通用方案2制备SMa23，如下式所示。

在0-10℃下，向含s23（0.9 g，6 mmol）的浓盐酸（10 ml）溶液中添加含NaNO₂（0.45>2-H₂O（3>

再按实施例1方法制备I-23，步骤二中用SMa23替换SMa1制备相应中间体c23，步骤三中用c23替换c1制备I-23。MS m/z (ESI): 243.1 [M+1]⁺。¹HNMR>

实施例24：制备I-24。

同实施例2的方法，将I-23 (10 mmol)和碘甲烷(30 mmol)溶于乙醇中，加入乙醇钠，回流搅拌18 h-24 h，回收溶剂经硅胶柱层析（乙酸乙酯：石油醚1：5）分离得I-24。MS m/z (ESI): 271.1 [M+1]⁺。¹HNMR>

实施例25：制备I-25。

同实施例4的方法，将I-37 (10 mmol)和碘乙烷(30 mmol)溶于乙醇中，加入乙醇钠，回流搅拌18 h-24 h，回收溶剂经硅胶柱层析（乙酸乙酯：石油醚1：5）分离得I-25。MS m/z (ESI): 345.2 [M+1]⁺。¹HNMR>

实施例26：制备I-26。

同实施例2的方法，将I-39 (10 mmol)和碘甲烷(10 mmol)溶于乙醇中，加入乙醇钠，0℃～40℃搅拌6 h-10 h，回收溶剂经硅胶柱层析（乙酸乙酯：石油醚1：3）分离得I-26。MS m/z (ESI): 271.1 [M+1]⁺。¹HNMR>

实施例27：制备I-27。

同实施例1的方法，步骤一中用乙腈替换丙腈制备SMb27，步骤二中用SMb27替换SMb1制备c27，步骤三中用c27替换c1还原制备I-27。MS m/z (ESI): 215.1 [M+1]⁺。¹HNMR>

实施例28：制备I-28。

同实施例2的方法，将I-27(10 mmol)和碘甲烷(30mmol)溶于乙醇中，加入乙醇钠，回流搅拌18 h-24 h，回收溶剂经硅胶柱层析（乙酸乙酯：石油醚 1：5）分离得I-28。MS m/z (ESI): 243.1 [M+1]⁺。¹HNMR>

实施例29：制备I-29。

同实施例2的方法，将I-38(10 mmol)和碘乙烷(30 mmol)溶于乙醇中，加入乙醇钠，回流搅拌18 h-24 h，回收溶剂经硅胶柱层析（乙酸乙酯：石油醚1：5）分离得I-29。MS m/z (ESI): 301.2 [M+1]⁺。¹HNMR>

实施例30：制备I-30。

同实施例2的方法，将I-27(10 mmol)和碘乙烷(30 mmol)溶于乙醇中，加入乙醇钠，回流搅拌18 h-24 h，回收溶剂经硅胶柱层析（乙酸乙酯：石油醚1：5）分离得I-30。MS m/z (ESI): 271.1 [M+1]⁺。¹HNMR>

实施例31：制备I-31。

同实施例2的方法，将I-27(10 mmol)和1-溴-5-氯戊烷(10 mmol)溶于乙醇中，加入乙醇钠，回流搅拌16 h-24 h，回收溶剂经硅胶柱层析（乙酸乙酯：石油醚1：5）分离得I-31。MS m/z (ESI): 283.2 [M+1]⁺。¹HNMR>

实施例32：制备I-32。

同实施例2的方法，将I-27(10 mmol)和溴甲基环丙烷(10 mmol)溶于乙醇中，加入乙醇钠，0℃～40℃搅拌6 h-10 h，回收溶剂经硅胶柱层析（乙酸乙酯：石油醚1：3）分离得I-32。MS m/z (ESI): 269.1 [M+1]⁺。¹HNMR>

实施例33：制备I-33。

同实施例2的方法，将I-40(10 mmol)和1-溴丙烯(10 mmol)溶于乙醇中，加入乙醇钠，0℃～40℃搅拌6 h-10 h，回收溶剂经硅胶柱层析（乙酸乙酯：石油醚1：3）分离得I-33。MS m/z (ESI): 269.1 [M+1]⁺。¹HNMR>

实施例34：制备I-34的制备。

同实施例2的方法，将I-27(10 mmol)和碘甲烷(10 mmol)溶于乙醇中，加入乙醇钠，0℃～40℃搅拌6 h-10 h，回收溶剂经硅胶柱层析（乙酸乙酯：石油醚1：3）分离得I-34。MS m/z (ESI): 229.1 [M+1]⁺。¹HNMR>

实施例35：制备I-35。

同实施例2的方法，将I-41(10 mmol)和碘甲烷(30 mmol)溶于乙醇中，加入乙醇钠，回流搅拌18 h-24 h，回收溶剂经硅胶柱层析（乙酸乙酯：石油醚1：5）分离得I-35。MS m/z (ESI): 271.1 [M+1]⁺。¹HNMR>

实施例36：制备I-36。

同实施例2的方法，将I-34(10 mmol)和碘乙烷(15 mmol)溶于乙醇中，加入乙醇钠，回流搅拌18 h-24 h，回收溶剂经硅胶柱层析（乙酸乙酯：石油醚1：5）分离得I-36。MS m/z (ESI): 257.1 [M+1]⁺。¹HNMR>

实施例37：制备I-37。

步骤一：先按通用方案2制备SMa37，如下式所示。

在0-10℃下，向含s37（1.18 g，6 mmol）的浓盐酸（10 ml）溶液中添加含NaNO₂（0.45>2-H₂O（3>

再按实施例1方法制备I-37，步骤二中用SMa37替换SMa1制备相应中间体c37，步骤三中用c37替换c1得到I-37。MS m/z (ESI): 289.1 [M+1]⁺。¹HNMR>

实施例38：制备I-38。

步骤一：先按通用方案2制备SMa38，如下式所示。

在0-10℃下，向含s38（1 g，6 mmol）的浓盐酸（10 ml）溶液中添加含NaNO₂（0.45>2-H₂O（3>

再按实施例1方法制备I-38，步骤二中用SMb27替换SMb1，SMa38替换SMa1制备c38，步骤三中用c38替换c1制备I-38。MS m/z (ESI): 245.1 [M+1]⁺。¹HNMR>

实施例39：制备I-39。

同实施例1的方法，步骤一中用异戊腈替换丙腈制备SMb39，步骤二中用SMb39替换SMb1制备c39，步骤三中用c39替换c1还原制备I-39。MS m/z (ESI): 257.1 [M+1]⁺。¹HNMR>

实施例40：制备I-40。

同实施例27的方法，步骤二中用SMb27与SMa23反应制备c40，步骤三中用c40替换c27还原制备I-40。MS m/z (ESI): 229.1 [M+1]⁺。¹HNMR>

实施例41：制备I-41。

步骤一：先按通用方案2制备SMa41，如下式所示。

在0-10℃下，向含s41（1 g，6 mmol）的浓盐酸（10 ml）溶液中添加含NaNO₂（0.45>2-H₂O（3>

再按实施例27方法制备I-41，步骤二中用SMb27与SMa41反应制备c41，步骤三中用c41替换c27还原制备I-41。MS m/z (ESI): 243.1 [M+1]⁺。¹HNMR>

实施例42：制备I-42。

同实施例1的方法，如下式所示，SMb42市售购买得到。步骤二中用SMb42与SMa1反应制备c42，步骤三中用c42替换c1还原制备I-42。MS m/z (ESI): 243.1 [M+1]⁺。¹HNMR>

实施例43：制备I-43。

同实施例42的方法。步骤一中用SMa21替换SMa1反应制备c43，步骤二中用c43替换c42还原制备I-43。MS m/z (ESI): 273.1 [M+1]⁺。¹HNMR>

实施例44：制备I-44。

同实施例2的方法，用I-42替换I-1制备I-44。MS m/z (ESI): 299.2 [M+1]⁺。¹HNMR>

实施例45：制备I-45。

同实施例2的方法，用I-43替换I-1制备I-45。MS m/z (ESI): 301.2 [M+1]⁺。¹HNMR>

活性测试

PARP-1酶抑制活性的测定：采用美国Trevigen公司的通用96孔化学发光分析试剂盒（货号：4676-096-K）。结果如表1所述。

测试原理基于PARP-1能够以NAD⁺依赖的形式催化多聚（ADP-核糖）往自身以及邻近的组蛋白等核蛋白聚合。该试剂盒检测96孔板上生物素标记的多聚（ADP-核糖）聚合到邻近组蛋白的反应。

按说明书操作，待测化合物用1X缓冲液按1:10进行连续系列稀释。在相应的包被有组蛋白的96孔板孔内加入10 μL待测化合物，15μL的PARP酶，总量为每孔0.5 IU和25 μL反应液。室温孵育60分钟后，分别用含0.1%TritonX-100的200 μL PBS及不含TritonX-100的200 μL PBS洗涤两次。等体积混合PeroxyGlowTW溶液A和B后，每孔加入100 μL，立即放入酶标仪进行化学发光读数。数据分析采用GraphPad公司的Prism 5软件，以对数化的化合物浓度对化学发光读数作图并用下列方程进行曲线方程拟合得出IC50值，Y (化学发光值) = 最小发光值+（最大发光值—最小发光值)/(1+10^ (LogC-LogIC50))，C是待测化合物浓度。

由表1可知，实施例中大多数化合物的IC50小于40 nM，部分化合物的IC50甚至小于10 nM，具有良好的PARP-1抑制活性。

活性最好的几个化合物I-4，I-5，I-7，I-19，I-29的Ki值分别为2.8 nM，1.9 nM，1.8 nM，2.4 nM，2.1 nM。计算公式如下所示。[S]是酶底物浓度，K_M是米氏常数。

药代动力学评价：

测试本发明化合物（I-4）、（I-5）、（I-19）、（I-29）的药代动力学。通过检测小鼠血浆及脑组织中药物浓度，研究本发明化合物在小鼠体内的药代动力学行为，评价其药动学特征。

按常规方法，以ICR小鼠为受试动物，应用LC/MS/MS法测定小鼠静脉注射和口服灌胃给予本发明化合物（I-4）、（I-5）、（I-19）、（I-29）后不同时刻血浆中的药物浓度（小鼠静脉注射2.0 mg/kg，口服灌胃5.0 mg/kg）。每只动物经颌下静脉采约30 μL血液，肝素钠抗凝。血液样本采集后置于冰上，离心分离血浆，收集的血浆分析前存放于-80℃。终点时将小鼠用乙醚麻醉，断头取脑。全脑剥离后用冰生理盐水漂洗，去除血丝，用滤纸吸去多余生理盐水后于-18℃冻存。精密称取脑组织匀浆，涡旋、提取，再经涡旋、高速离心后取上清液，减压干燥后用甲醇复溶，涡旋、离心后取上清液测定。其结果总结于表2。

表2. 本发明化合物I-4、I-5、I-19、I-29的口服给药的药代动力学参数

由表2结果可见，本发明化合物具有较好的药代动力学特征，有良好的口服生物利用度，尤其具有良好的血脑屏障（BBB）通透性，在脑组织中的药物浓度显著高于血浆中药物浓度，在脑组织与血浆中药物浓度的比值均可达到2.5~3倍以上，对于脑肿瘤或易于发生脑转移的肿瘤具有潜在的治疗效果。

综上所述，本发明所提供的吡唑并喹唑啉酮衍生物对PARP-1具有显著的选择性抑制作用，大多数化合物的IC50小于40 nM，抑制活性比公开的类似分子明显更高，且具有较好的药代动力学特征，口服生物吸收度良好，尤其具有穿透血脑屏障的良好特性，在脑肿瘤中有较好应用前景。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。