公开/公告号CN109164256A
专利类型发明专利
公开/公告日2019-01-08
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申请/专利权人 北京华科泰生物技术有限公司;
申请/专利号CN201811037500.7
发明设计人 林斯;
申请日2018-09-06
分类号
代理机构北京汇泽知识产权代理有限公司;
代理人张瑾
地址 101111 北京市通州区科创东五街2号14幢4层F4E
入库时间 2024-02-19 06:45:23
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2020-07-07
授权
授权
2019-03-08
著录事项变更 IPC(主分类):G01N33/543 变更前: 变更后: 申请日:20180906
著录事项变更
2019-02-01
实质审查的生效 IPC(主分类):G01N33/543 申请日:20180906
实质审查的生效
2019-01-08
公开
公开
技术领域
本发明属于医学检验领域，尤其是涉及一种金属氧化物标记的免疫复合物、其制备方法、均相电化学免疫分析测量装置及其在均相电化学免疫分析中的应用。
背景技术
电化学检测技术是近年来新兴的灵敏分析检测技术，是一种以不同方式的电信号作为激发与检测信号的分析检测技术。电化学检测技术由于其操作简单、灵敏度高和检测速度快等优势而备受青睐，已经在生命科学、生物科学、临床分析、环境监测以及表面科学等领域得到了广泛的研究与应用。
电化学传感器可实现经济、高效、实用、快速、灵敏、精确的检测与分析，是一种将电化学分析与传感技术结合所产生的一种传感器件，其检测原理是基于被测物质影响电极体系的电化学信号，从而实现对被测物质的定量分析。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种提高检测灵敏度，方法稳定性高、重复性好、结果快速准确可靠的金属氧化物标记的免疫复合物、其制备方法、均相电化学免疫分析测量装置及其在均相电化学免疫分析中的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种金属氧化物标记的免疫复合物，包括金属氧化物标记的一株抗体或抗原，磁性微球标记的待测物的另一株抗体，和待测物。
作为上述一种免疫复合物的优选方案，其中所述金属氧化物为氧化铜。
作为上述一种免疫复合物的优选方案，其中所述氧化铜选自1)裸露的氧化铜纳米颗粒；或2)氧化铜表面包覆一层二氧化硅、二氧化钛、碳酸盐、硅酸盐、磷酸盐、碳化硅、石墨、氮化硅中的一种；或3)氧化铜表面包覆一层有机硅、聚苯乙烯、聚四氟乙烯、聚酰胺、聚乙烯、聚氯乙烯、聚氟乙烯、聚丙烯腈、聚酰胺、聚酰亚胺、聚苯胺、聚吡咯、聚丙烯酸、壳聚糖、聚乳酸、环氧树脂、酚醛树脂、聚炔、聚酯、β-环糊精聚合物、维生素、三聚氰胺中的一种；所述抗体或抗原为待测物的抗体或抗原。
作为上述一种免疫复合物的优选方案，其中所述氧化铜的粒径为1～500nm。
进一步地，其中所述金属氧化物标记的一株抗体或抗原通过具有特异亲和性的一对物质进行连接。
进一步地，其中所述具有特异亲和性的一对物质为生物素和链酶亲和素、生物素和亲和素、荧光素和抗荧光素、抗体和特异性结合此抗体的二抗。
进一步地，其中所述磁性微球标记的待测物的一株抗体通过具有特异亲和性的一对物质进行连接。
进一步地，其中所述具有特异亲和性的一对物质为生物素和链酶亲和素、生物素和亲和素、荧光素和抗荧光素、抗体和特异性结合此抗体的二抗。
一种上述金属氧化物标记的免疫复合物的制备方法，包括以下步骤：
步骤一，金属氧化物标记待测物的一株抗体或抗原；
步骤二，具有特异亲和性一对物质中的一个标记待测物的另一株抗体；
步骤三，具有特异亲和性一对物质中的另一个标记磁性微球；
步骤四，将待测物、金属氧化物标记的抗体或抗原和具有特异亲和性一对物质中的一个标记的抗体加入检测池中，进行温育反应，继续加入具有特异亲和性的一对物质中的另一个标记的磁性微球，形成金属氧化物标记的免疫复合物；
或者为，
步骤一，金属氧化物标记待测物的一株抗体或抗原；
步骤二，磁性微球标记待测物的另一株抗体；
步骤三，将待测物、金属氧化物标记待测物的一株抗体或抗原和磁性微球标记待测物的另一株抗体加入到检测池中，进行温育反应，形成金属氧化物标记的免疫复合物；
或者为，
步骤一，具有特异亲和性的一对物质中的一个标记待测物的一株抗体或抗原；
步骤二，磁性微球标记待测物的另一株抗体；
步骤三，金属氧化物标记具有特异亲和性的一对物质中的另一个；
步骤四，将待测物、具有特异亲和性的一对物质中的一个标记待测物的一株抗体或抗原和磁性微球标记待测物的另一株抗体，加入检测池中，进行温育反应，继续加入金属氧化物标记的具有特异亲和性的一对物质中的另一个，形成金属氧化物标记的免疫复合物。
作为上述金属氧化物标记的免疫复合物的优选方案，其中所述磁性微球为磁性的Fe3O4、γ-Fe2O3、Pt、Ni或Co微球，或者为磁性的Fe3O4、γ-Fe2O3、Pt、Ni或Co与无机物或有机物形成的核/壳结构或掺杂结构的微球。
一种均相电化学免疫分析测量装置，包括四电极体系、检测池和磁铁，所述四电极体系采用丝网印刷电极，分别为工作电极、内控电极、对电极和参比电极，所述丝网印刷电极插入检测池中，在检测池中对应丝网印刷电极中工作电极的下方设置所述磁铁。
作为上述一种均相电化学免疫分析测量装置的优选方案，其中所述工作电极为铜电极、碳电极、玻碳电极、金微电极、石墨电极、银电极、铅电极，或者在上述电极里掺杂石墨烯或富勒烯的电极，或者在上述电极表面修饰、涂覆、掺杂或贴有石墨烯或富勒烯；所述内控电极为铜电极、碳电极、玻碳电极、金微电极、石墨电极、银电极、铅电极，或者在上述电极里掺杂石墨烯或富勒烯的电极，或者在上述电极表面修饰、涂覆、掺杂或贴有石墨烯或富勒烯；所述对电极为铂丝电极或碳电极；所述参比电极为甘汞电极、Ag/AgCl电极。
一种均相电化学免疫分析测量方法，采用上述的装置进行测量，包括以下步骤：
步骤S1，将丝网印刷电极插入到检测池中，在检测池中制备上述的金属氧化物标记的免疫复合物；
步骤S2，将所述金属氧化物标记的免疫复合物富集到工作电极表面，移除反应后的液体，向检测池中加入电解液；
步骤S3，进行基数校准，测定金属氧化物发生还原反应的伏安曲线图，计算半峰面积，制备作标准曲线，并计算待测物的含量。
作为上述一种均相电化学免疫分析测量方法的优选方案，其中所述均相电化学免疫分析测量方法包括以下步骤：
步骤S1，将丝网印刷电极插入到检测池中，向检测池中加入待测样本、金属氧化物标记的待测物的一株抗体或抗原和生物素标记的待测物的另一株抗体，温育反应，继续向检测池中加入链酶亲和素标记的磁性微球，生物素和链酶亲和素进行特异性结合，形成金属氧化物标记的免疫复合物；
步骤S2，通过磁分离将金属氧化物标记的免疫复合物富集到工作电极表面，移除反应后的液体，向检测池中加入电解液；
步骤S3，先将内控电极、对电极和参比电极连接到电化学工作站上，测定基体的伏安曲线图，进行基数校准；然后再将工作电极、对电极和参比电极连接到电化学工作站上，标记在免疫复合物上的金属氧化物在工作电极表面发生还原反应，通过伏安法测定金属离子的伏安曲线图，然后在测得的伏安曲线图中找出金属离子的特征峰，计算半峰面积，用半峰面积与待测物浓度之间用Log-Log或Log-Logit回归方程或四参数方程进行拟合制备标准曲线，通过标准曲线计算待测物的含量。
作为上述一种均相电化学免疫分析测量方法的优选方案，其中所述均相电化学免疫分析测量方法包括以下步骤：
步骤S1，将丝网印刷电极插入到检测池中，向检测池中加入待测样本、金属氧化物标记的待测物的一株抗体或抗原和磁性微球标记待测物的另一株抗体加入到检测池中，进行温育反应，形成金属氧化物标记的免疫复合物；
步骤S2，通过磁分离将金属氧化物标记的免疫复合物富集到工作电极表面，移除反应后的液体，向检测池中加入电解液；
步骤S3，先将内控电极、对电极和参比电极连接到电化学工作站上，测定基体的伏安曲线图，进行基数校准；然后再将工作电极、对电极和参比电极连接到电化学工作站上，标记在免疫复合物上的金属氧化物在工作电极表面发生还原反应，通过伏安法测定金属离子的伏安曲线图，然后在测得的伏安曲线图中找出金属离子的特征峰，计算半峰面积，用半峰面积与待测物浓度之间用Log-Log或Log-Logit回归方程或四参数方程进行拟合制备标准曲线，通过标准曲线计算待测物的含量。
作为上述一种均相电化学免疫分析测量方法的优选方案，其中所述均相电化学免疫分析测量方法包括以下步骤：
步骤S1，将丝网印刷电极插入到检测池中，向检测池中加入待测样本、具有特异亲和性的一对物质中的一个标记待测物的一株抗体或抗原和磁性微球标记待测物的另一株抗体，加入检测池中，进行温育反应，继续加入金属氧化物标记的具有特异亲和性的一对物质中的另一个，形成金属氧化物标记的免疫复合物
步骤S2，通过磁分离将金属氧化物标记的免疫复合物富集到工作电极表面，移除反应后的液体，向检测池中加入电解液；
步骤S3，先将内控电极、对电极和参比电极连接到电化学工作站上，测定基体的伏安曲线图，进行基数校准；然后再将工作电极、对电极和参比电极连接到电化学工作站上，标记在免疫复合物上的金属氧化物在工作电极表面发生还原反应，通过伏安法测定金属离子的伏安曲线图，然后在测得的伏安曲线图中找出金属离子的特征峰，计算半峰面积，用半峰面积与待测物浓度之间用Log-Log或Log-Logit回归方程或四参数方程进行拟合制备标准曲线，通过标准曲线计算待测物的含量。
作为上述一种均相电化学免疫分析测量方法的优选方案，其中所述金属氧化物为氧化铜。
作为上述一种均相电化学免疫分析测量方法的优选方案，其中所述氧化铜选自1)裸露的氧化铜纳米颗粒；或2)氧化铜表面包覆一层二氧化硅、二氧化钛、碳酸盐、硅酸盐、磷酸盐、碳化硅、石墨、氮化硅中的一种；或3)氧化铜表面包覆一层有机硅、聚苯乙烯、聚四氟乙烯、聚酰胺、聚乙烯、聚氯乙烯、聚氟乙烯、聚丙烯腈、聚酰胺、聚酰亚胺、聚苯胺、聚吡咯、聚丙烯酸、壳聚糖、聚乳酸、环氧树脂、酚醛树脂、聚炔、聚酯、β-环糊精聚合物、维生素、三聚氰胺中的一种；所述抗体或抗原为待测物的抗体或抗原。
作为上述一种均相电化学免疫分析测量方法的优选方案，其中所述氧化铜的粒径为1～500nm。
作为上述一种均相电化学免疫分析测量方法的优选方案，其中在步骤S1中，所述温育反应的时间为3～90min。
作为上述一种均相电化学免疫分析测量方法的优选方案，其中在步骤S2中，移除反应池中的剩余液体后可采用PB缓冲液洗涤2～3遍，再加注电解液。
作为上述一种均相电化学免疫分析测量方法的优选方案，其中所述电解液为0.01M～0.6M、pH＝7.4的磷酸缓冲溶液；0.01M～0.6M、pH＝3～7的柠檬酸缓冲溶液；0.01M～0.6M、pH＝2～7的醋酸缓冲溶液；由0.1mM～1M的K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]和0.1mM～1M的KCl组成的铁氰化钾电解液。
本发明具有以下有益效果：
1、由于采用上述技术方案，采用金属氧化物作为标记材料，利用金属氧化物的电化学特性以及电化学法对对金属离子发生氧化或还原反应检测的高度灵敏性，可以大大提高检测灵敏度，该方法稳定性高、重复性好、结果准确可靠，实现了快速、灵敏检测的目的，拓展了基于金属氧化物标记的电化学检测方法在体外诊断领域中的应用。
2、目前，通过电化学检测的方法一般采用伏安曲线图中特征物质的特征峰高来建立与待测物浓度的关系；本申请中通过找出伏安曲线图中特征物质的特征峰，然后计算半峰面积，用半峰面积与待测物浓度之间的关系建立标准曲线，通过标准曲线计算待测物的含量，更能准确、稳定的反应待测物的含量。
3、与传统电化学检测中直接将待测物抗体或抗原包被于电极表面相比，本发明中采用磁性微球收集免疫复合物，然后通过磁分离将带有免疫复合物的磁性微球富集于电极表面，有利于减小实验误差，提高检测灵敏度。
4、本发明申请采用丝网印刷电极，并且丝网印刷电极采用四电极体系，分别设有工作电极、内控电极、对电极和参比电极。其中内控电极的作用在于校准基线，避免电化学反应的波动，减小检测误差。
附图说明
下面通过参考附图并结合实例具体地描述本发明，本发明的优点和实现方式将会更加明显，其中附图所示内容仅用于对本发明的解释说明，而不构成对本发明的任何意义上的限制，在附图中：
图1为铜离子的伏安曲线图，其中PCT校准品的浓度为(a)S0＝0ng/mL、(b)S1＝0.02ng/mL、(c)S2＝1ng/mL、(d)S3＝5ng/mL、(e)S4＝25ng/mL、(f)S5＝100ng/mL；
图2为PCT的标准曲线图；
图3为PCT测定结果的相关性图；
图4为铜离子的伏安曲线图，其中FT4校准品的浓度为S0＝0pg/mL、(b)S1＝1pg/mL、(c)S2＝3pg/mL、(d)S3＝10pg/mL、(e)S4＝30pg/mL、(f)S5＝100pg/mL；
图5为FT4的标准曲线图；
图6为FT4测定结果的相关性图；
图7为Fer的标准曲线图；
图8为Fer测定结果的相关性图；
图9为FT3的标准曲线图；
图10为FT3测定结果的相关性图；
图11为HE4的标准曲线图；
图12为HE4测定结果的相关性图；
图13为25-OH-D的标准曲线图；
图14为25-OH-D测定结果的相关性图；
图15为Cu2+包覆在聚苯乙烯微球表面作为标记物的稳定性比较，(a)表面包覆了Cu2+的聚苯乙烯微球标记抗体完成后检测，(b)将表面包覆了Cu2+的聚苯乙烯微球标记的抗体于37℃下放置3天后检测；
图16为CuO作为标记物的稳定性比较，a)CuO标记抗体完成后检测，(b)将CuO标记的抗体于37℃下放置3天后检测；
图17为CuO作为标记物的伏安曲线图；
图18为氧化锌作为标记物的伏安曲线图；
图19为使用内控电极进行基数校准前后CuO作为标记物的伏安曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
以下各材料或试剂，除非特别说明，均为市售。
实施例1：以检测降钙素原(PCT)为例(夹心法)
1.纳米氧化铜标记一株鼠抗人PCT单克隆抗体：
先用PBS缓冲液将一株鼠抗人PCT单克隆抗体稀释成1mg/mL，并用PBS缓冲液室温(25℃±5℃)避光搅拌4小时进行透析备用；在1-10mL(优选5mL)(质量分数1g/100mL，纯度99.9％)制备的纳米氧化铜(1-100nm，优选30-40nm)材料中加入1mL一株鼠抗人PCT单克隆抗体溶液，在25℃±5℃下避光磁力搅拌30min，然后在10000r/min条件下离心5-30min(优选10min)去除上清液，随后用含1-10wt％(优选10％)牛血清白蛋白BSA10mL复溶后封闭1-5h(优选3h)。然后在3000-8000r/min(优选5000r/min)条件下离心5-30min(优选10min)，最后取出上清液2-8℃保存即可。工作液以PBS缓冲液稀释100-5000倍备用(优选300)。其中采用优选方案的标记效果更好、更稳定。
2.生物素标记另一株鼠抗人PCT单克隆抗体：
先用碳酸钠缓冲液将另一株鼠抗人PCT单克隆抗体稀释成1mg/mL，并用碳酸钠缓冲液室温(25℃±5℃)避光搅拌1-5h(优选4小时)后透析；随后用N,N-二甲基酰胺(DMF)将6–氨基己酸-N羟基琥珀酰亚胺-生物素(BCNHS)配制成1mg/mL；在1mL的另一株鼠抗人PCT单克隆抗体溶液中加入上述DMF溶液10-160μL(优选80μL)，玻璃瓶中混合，室温(25℃±5℃)避光搅拌1-5h(优选2h)；加入1mol/L氯化铵溶液5-20μL(优选9.6μL)，室温(25℃±5℃)避光搅拌10分钟；然后混合溶液转入透析袋，用磷酸缓冲液4℃透析过夜。最后取出加等量甘油-20℃保存即可。工作液以PBS缓冲液稀释100-5000倍备用(优选300)。其中采用优选方案的标记效果更好、更稳定。
3.链酶亲和素标记的磁性微球：
取0.5mL，2.5mg/mL磁性微球(粒径为300nm-3000nm，优选800nm，购自西格玛)用磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)洗涤2次后重悬于10mL的磷酸缓冲溶液中，继续加入4mL的戊二醛室温震荡反应10h，反应结束后用纯化水进行洗涤2～3次，将磁性微球重悬于10mL的磷酸缓冲溶液中；将0.5mg的链酶亲和素溶于1mL的磷酸缓冲溶液中，然后加入磁性微球的磷酸缓冲溶液中，室温震荡8h，反应结束后用磷酸缓冲溶液洗涤2～3次，然后分散在10mL的磷酸缓冲溶液中备用。其中采用优选方案的标记效果更好、更稳定。
4.检测过程如下：
(1)将10-100μL(优选25μL)含有PCT的待测样本、10-150μL(优选100μL)的纳米氧化铜标记的一株鼠抗人PCT单克隆抗体和10-150μL(优选50μL)生物素标记另一株鼠抗人PCT单克隆抗体加入到反应池中，经过3-90min(优选15min)的温育反应，形成一端标记有纳米氧化铜、另一端标记有生物素的PCT免疫复合物；
(2)然后向步骤(1)反应后的混合物中加入10-100μL(优选50μL)表面标记有链酶亲和素的磁性微球，标记在PCT免疫复合物一端的生物素与标记在磁性微球表面的链酶亲和素进行特异性结合，形成表面结合了PCT免疫复合物的磁性微球；
(3)采用磁分离的方式将步骤(2)中表面结合了PCT免疫复合物的纳米微球固定到工作电极表面，然后移除反应池中的剩余液体，并加注25-1000μL(优选100μL)柠檬酸电解液；
(4)采用四电极体系进行测定，将工作电极(石墨电极)、内控电极(碳电极)、对电极(铂电极或碳电极)和参比电极(Ag/AgCl电极)的丝网印刷电极进行电化学检测。先将内控电极、对电极和参比电极连接到电化学工作站上，测定基体的伏安曲线图，进行基数校准，然后再将工作电极、对电极和参比电极连接到电化学工作站上，利用伏安法测定磁性微球表面的免疫复合物上的纳米氧化铜发生还原反应的伏安曲线图，然后在测得的伏安曲线图中找出铜金属离子理论特征峰，计算半峰面积，用半峰面积与PCT浓度之间用Log-Log线性回归方程或四参数方程(优选四参数方程)进行拟合制备PCT标准曲线，通过标准曲线计算PCT的含量。
其中采用上述各步骤中的优选方案，检测的灵敏度更高、稳定性更好。
5.标准曲线的建立：
配置浓度为0、0.02、1、5、25、100ng/mL的PCT校准品用于建立PCT标准曲线，检测灵敏度为0.02ng/mL，检测范围为0.02～100ng/mL，铜离子的伏安曲线图如图1所示，检测数据如表1所示，标准曲线如图2所示。
表1检测数据
6.与罗氏结果对比：
采用本发明中的方法和罗氏电化学发光法对13例样本进行检测，检测结果如表2所示，对检测结果进行相关性分析如图3所示，回归方程为y＝0.86498x+0.1423，R2＝0.9737，表明本方法与罗氏的电化学发光法具有良好的相关性。
表2本方法与罗氏电化学法检测结果对比
实施例2：以检测游离甲状腺素(FT4)为例(竞争法)
1.纳米氧化铜标记FT4完全抗原：
先用PBS缓冲液将FT4完全抗原稀释成1mg/mL，并用PBS缓冲液室温(25℃±5℃)避光搅拌4小时进行透析备用；在1-10mL(优选2mL)(质量分数1g/100mL，纯度99.9％)制备的纳米氧化铜(1-100nm，优选30-40nm)材料中加入1mLFT4完全抗原溶液，在25℃±5℃下避光磁力搅拌30min，然后在10000r/min条件下离心5-30min(优选10min)去除上清液，随后用含1-10％(优选10％)BSA>
2.生物素标记另一株羊抗人FT4多克隆抗体：
先用碳酸钠缓冲液将另一株羊抗人FT4多克隆抗体稀释成1mg/mL，并用碳酸钠缓冲液室温(25℃±5℃)避光搅拌1-5h(优选4小时)后透析；随后用N,N-二甲基酰胺(DMF)将6–氨基己酸-N羟基琥珀酰亚胺-生物素(BCNHS)配置成1mg/mL；在1mL的羊抗人FT4多克隆抗体溶液中加入上述DMF溶液10-160μL(优选40μL)，玻璃瓶中混合，室温(25℃±5℃)避光搅拌1-5h(优选2小时)；加入1mol/L氯化铵溶液5-20μL(优选15μL)，室温(25℃±5℃)避光搅拌10分钟；然后混合溶液转入透析袋，用磷酸缓冲液4℃透析过夜。最后取出加等量甘油-20℃保存即可。工作液以PBS缓冲液稀释100-5000倍备用(优选300)。其中采用优选方案的标记效果更好、更稳定。
3.链酶亲和素标记的磁性微球：
取0.5mL，2.5mg/mL磁性微球(粒径为300nm-3000nm，优选800nm，购自西格玛)用磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)洗涤2次后重悬于10mL的磷酸缓冲溶液中，继续加入4mL的戊二醛室温震荡反应10h，反应结束后用纯化水进行洗涤2～3次，将磁性微球重悬于10mL的磷酸缓冲溶液中；将0.5mg的链酶亲和素溶于1mL的磷酸缓冲溶液中，然后加入磁性微球的磷酸缓冲溶液中，室温震荡8h，反应结束后用磷酸缓冲溶液洗涤2～3次，然后分散在10mL的磷酸缓冲溶液中备用。其中采用优选方案的标记效果更好、更稳定。
4.检测过程如下：
(1)将10-100μL(优选50μL)含有FT4的待测样本、10-150μL(优选50μL)的纳米氧化铜标记的FT4完全抗原和10-150μL(优选50μL)生物素标记羊抗人FT4多克隆抗体加入到反应池中，经过3-90min(优选15min)的温育反应，待测样本中的FT4、纳米氧化铜标记的FT4完全抗原竞争与生物素标记羊抗人FT4多克隆抗体反应形成一端标记有氧化铜、另一端标记有生物素的FT4免疫复合物I和一端标记有生物素的FT4免疫复合物II；
(2)然后向步骤(1)反应后的混合物中加入10-100μL(优选50μL)表面标记有链酶亲和素的磁性微球，标记在FT4免疫复合物I和FT4免疫复合物II一端的生物素与标记在磁性微球表面的链酶亲和素进行特异性结合，形成表面结合了FT4免疫复合物I和FT4免疫复合物II的磁性微球；
(3)采用磁分离的方式将步骤(2)中表面结合了FT4免疫复合物的I和FT4免疫复合物II的磁性微球固定到工作电极表面，然后移除反应池中的剩余液体，并加注25-1000μL(优选100ul)柠檬酸电解液；
(4)采用四电极体系进行测定，将工作电极(金微电极)、内控电极(银电极)、对电极(铂电极或碳电极)和参比电极(Ag/AgCl电极)的丝网印刷电极进行电化学检测。先将内控电极、对电极和参比电极连接到电化学工作站上，测定基体的伏安曲线图，进行基数校准，然后再将工作电极、对电极和参比电极连接到电化学工作站上，利用伏安法测定磁性微球表面的免疫复合物上的纳米氧化铜发生还原反应的伏安曲线图，然后在测得的伏安曲线图中找出铜离子的特征峰，计算半峰面积，用半峰面积与PCT浓度之间用Log-Logit线性回归方程或四参数方程(优选四参数方程)进行拟合制备FT4标准曲线，通过标准曲线计算FT4的含量。
其中采用上述各步骤中的优选方案，检测的灵敏度更高、稳定性更好。
5.标准曲线的建立：
配制浓度为0、1、3、10、30、100pg/mL的FT4校准品用于建立FT4标准曲线，检测灵敏度为0.5pg/mL，检测范围为1～100pg/mL，铜离子的伏安曲线图如图4所示，检测数据如表3所示，标准曲线如图5所示。
表3检测数据
6.与罗氏结果对比：
采用本发明中的方法和罗氏电化学发光法对17例样本进行检测，检测结果如表4所示，对检测结果进行相关性分析如图6所示，回归方程为y＝1.1262x+1.9277，R2＝0.9797，表明本方法与罗氏的电化学发光法具有良好的相关性。
表4本方法与罗氏电化学法检测结果比对
实施例3：以检测铁蛋白(Fer)为例(夹心法)
1.纳米氧化铜标记一株鼠抗人Fer单克隆抗体：
先用PBS缓冲液将一株鼠抗人Fer单克隆抗体稀释成1mg/mL，并用PBS缓冲液室温(25℃±5℃)避光搅拌4小时进行透析备用；在1-10mL(优选5mL)(质量分数1g/100mL，纯度99.9％)制备的纳米氧化铜(1-100nm，优选30-40nm)材料中加入1mL一株鼠抗人Fer单克隆抗体溶液，在25℃±5℃下避光磁力搅拌30min，然后在10000r/min条件下离心5-30min(优选10min)去除上清液，随后用含1-10％(优选10％)BSA 10mL复溶后封闭1-5h(优选3h)。然后在3000-8000r/min(优选6000r/min)条件下离心5-30min(优选15min)，最后取出上清液2-8℃保存即可。工作液以PBS缓冲液稀释100-5000倍备用(优选2000)。其中采用优选方案的标记效果更好、更稳定。
2.另一株鼠抗人Fer单克隆抗体标记的磁性微球：
取0.5mL，2.5mg/mL磁性微球(粒径为300nm-3000nm，优选800nm，购自西格玛)用磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)洗涤2次后重悬于10mL的磷酸缓冲溶液中，继续加入4mL的戊二醛室温震荡反应10h，反应结束后用纯化水洗涤2～3次，将磁性微球重悬于10mL的磷酸缓冲溶液中；用碳酸钠缓冲液将另一株鼠抗人Fer单克隆抗体稀释成1mg/mL，并用碳酸钠缓冲液室温(25℃±5℃)避光搅拌1-5h(优选2小时)后透析；吸取0.5-5mL(优选1mL)抗体并加入10mL磁性微球的磷酸缓冲溶液中，室温震荡8h，用磁铁将磁性微球吸于一侧，PBS洗涤3次，洗涤后分散在10mL的磷酸缓冲溶液中即可。其中采用优选方案的标记效果更好、更稳定。
3.检测过程如下：
(1)将10-100μL(优选25μL)含有Fer的待测样本、10-150μL(优选100μL)的纳米氧化铜标记的一株鼠抗人Fer单克隆抗体和10-150μL(优选50μL)磁性微球标记另一株鼠抗人Fer单克隆抗体加入到反应池中，经过3-90min(优选10min)的温育反应，形成一端标记有纳米氧化铜、另一端有磁性微球的Fer免疫复合物；
(2)采用磁分离的方式将步骤(1)中表面结合了Fer免疫复合物的纳米微球固定到表面涂覆有石墨稀或富勒烯的工作电极表面，然后移除反应池中的剩余液体，并加注25-1000μL(优选100uL)柠檬酸电解液；
(3)采用四电极体系进行测定，将工作电极(碳电极)、内控电极(石墨电极)、对电极(铂电极或碳电极)和参比电极(Ag/AgCl电极)的丝网印刷电极进行电化学检测。先将内控电极、对电极和参比电极连接到电化学工作站上，测定基体的伏安曲线图，进行基数校准，然后再将工作电极、对电极和参比电极连接到电化学工作站上，利用伏安法测定磁性微球表面的免疫复合物上的纳米氧化铜发生还原反应的伏安曲线图，然后在测得的伏安曲线图中找出铜离子的特征峰，计算半峰面积，用半峰面积与Fer浓度之间用Log-Log线性回归方程或四参数方程(优选四参数方程)进行拟合制备Fer标准曲线，通过标准曲线计算Fer的含量。
其中采用上述各步骤中的优选方案，检测的灵敏度更高、稳定性更好。
5.标准曲线的建立：
配置浓度为0、0.5、5、30、200、1000ng/mL的的Fer校准品用于建立Fer标准曲线，检测灵敏度为0.1ng/mL，检测范围为0.5～1000ng/mL，，检测数据如表5所示，标准曲线如图7所示。
表5检测数据
6.与罗氏结果对比：
采用本发明中的方法和罗氏电化学发光法对20例样本进行检测，检测结果如表6所示，对检测结果进行相关性分析如图8所示，回归方程为y＝0.9341x+2.1006，R2＝0.9839，表明本方法与罗氏的电化学发光法具有良好的相关性。
表6本方法与罗氏电化学法检测结果对比
实施例4：以检测游离三碘甲腺原氨酸(FT3)为例(竞争法)
1.纳米氧化铜标记FT3完全抗原：
先用PBS缓冲液将FT3完全抗原稀释成1mg/mL，并用PBS缓冲液室温(25℃±5℃)避光搅拌4小时进行透析备用；在1-10mL(优选2mL)(质量分数1g/100mL，纯度99.9％)制备的纳米氧化铜(1-100nm，优选30-40nm)材料中加入1mLFT3完全抗原溶液，在25℃±5℃下避光磁力搅拌30min，然后在10000r/min条件下离心5-30min(优选10min)去除上清液，随后用含1-10％(优选10％)BSA>
2.另一株羊抗人FT3多抗标记的磁性微球：
取0.5mL，2.5mg/mL磁性微球(粒径为300nm-3000nm，优选800nm，购自西格玛)用磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)洗涤2次后重悬于10mL的磷酸缓冲溶液中，继续加入4mL的戊二醛室温震荡反应10h，反应结束后纯化水洗涤2～3次，将磁性微球重悬于10mL的磷酸缓冲溶液中；用碳酸钠缓冲液将一株羊抗人FT3多抗稀释成1mg/mL，并用碳酸钠缓冲液室温(25℃±5℃)避光搅拌1-5h(优选2小时)后透析；吸取0.5-5mL(优选1mL)抗体并加入10mL磁性微球的磷酸缓冲溶液中，室温震荡8h，用磁铁将磁性微球吸于一侧，PBS洗涤3次，洗涤后分散在10mL的磷酸缓冲溶液中即可。其中采用优选方案的标记效果更好、更稳定。
3.检测过程如下：
(1)将10-100μL(优选50μL)含有FT3的待测样本、10-150μL(优选100μL)的纳米氧化铜标记的一株FT3完全抗原和10-150μL(优选50μL)磁性微球标记另一株羊抗人FT3多抗加入到反应池中，经过3-90min(优选15min)的温育反应，待测样本中的FT3、氧化铜标记的一株FT3完全抗原竞争与磁性微球表面标记的另一株羊抗人FT3多抗发生免疫反应，形成磁性微球表面结合待测样本中FT3的免疫复合物I和结合氧化铜标记的一株FT3完全抗原的免疫复合物II；
(2)采用磁分离的方式将步骤(1)中表面结合了免疫复合物I和免疫复合物II的磁性微球固定到工作电极表面，然后移除反应池中的剩余液体，并加注25-1000μL(优选100μL)柠檬酸电解液；
(3)采用四电极体系进行测定，将工作电极(玻碳电极)、内控电极(碳电极)、对电极(铂电极或碳电极)和参比电极(Ag/AgCl电极)的丝网印刷电极进行电化学检测。先将内控电极、对电极和参比电极连接到电化学工作站上，测定基体的伏安曲线图，进行基数校准，然后再将工作电极、对电极和参比电极连接到电化学工作站上，利用伏安法测定磁性微球表面的免疫复合物上的纳米氧化铜进行还原反应的伏安曲线图，然后在测得的伏安曲线图中铜离子的特征峰，计算半峰面积，用半峰面积与FT3浓度之间用Log-Logit线性回归方程或四参数方程(优选四参数方程)进行拟合制备FT3标准曲线，通过标准曲线计算FT3的含量。
其中采用上述各步骤中的优选方案，检测的灵敏度更高、稳定性更好。
5.标准曲线的建立：
配置浓度为0、0.1、0.5、3、10、50pg/mL的的FT3校准品用于建立FT3标准曲线，检测灵敏度为0.05pg/mL，检测范围为0.1～50pg/mL，检测数据如表7所示，标准曲线如图9所示。
表7检测数据
6.与罗氏结果对比：
采用本发明中的方法和罗氏电化学发光法对20例样本进行检测，检测结果如表8所示，对检测结果进行相关性分析如图10所示，回归方程为y＝1.2359x+0.3003，R2＝0.959，表明本方法与罗氏的电化学发光法具有良好的相关性。
表8本方法与罗氏电化学法检测结果对比
实施例5：以人附睾蛋白4(HE4)为例(夹心法)
1.纳米氧化铜标记链霉亲和素：
先用PBS缓冲液将链霉亲和素稀释成1mg/mL，并用PBS缓冲液室温(25℃±5℃)避光搅拌4小时进行透析备用；在1-10mL(优选3mL)(质量分数1g/100mL，纯度99.9％)制备的纳米氧化铜(1-100nm，优选30-40nm)材料中加入1mL链霉亲和素溶液，在25℃±5℃下避光磁力搅拌30min，然后在10000r/min条件下离心5-30min(优选15min)去除上清液，随后用含1-10％(优选10％)BSA 10mL复溶后封闭1-5h(优选3h)。然后在3000-8000r/min(优选5000r/min)条件下离心5-30min(优选20min)，最后取出上清液2-8℃保存即可。工作液以PBS缓冲液稀释100-5000倍备用(优选100)。其中采用优选方案的标记效果更好、更稳定。
2.生物素标记一株鼠抗人HE4单克隆抗体：
先用碳酸钠缓冲液将一株鼠抗人HE4单克隆抗体稀释成1mg/mL，并用碳酸钠缓冲液室温(25℃±5℃)避光搅拌1-5h(优选4小时)后透析；随后用N,N-二甲基酰胺(DMF)将6–氨基己酸-N羟基琥珀酰亚胺-生物素(BCNHS)配置成1mg/mL；在1mL的一株鼠抗人HE4单克隆抗体溶液中加入上述DMF溶液10-160μL(优选80μL)，玻璃瓶中混合，室温(25℃±5℃)避光搅拌1-5h(优选2小时)；加入1mol/L氯化铵溶液5-20μL(优选9.6μL)，室温(25℃±5℃)避光搅拌10分钟；然后混合溶液转入透析袋，用磷酸缓冲液4℃透析过夜。最后取出加等量甘油-20℃保存即可。工作液以PBS缓冲液稀释100-5000倍备用(优选300)。其中采用优选方案的标记效果更好、更稳定。
3.另一株鼠抗人HE4单克隆抗体标记的磁性微球：
取0.5mL，2.5mg/mL磁性微球(粒径为300nm-3000nm，优选800nm，购自西格玛)用磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)洗涤2次后重悬于10mL的磷酸缓冲溶液中，继续加入4mL的戊二醛室温震荡反应10h，反应结束后用纯化水洗涤2～3次，将磁性微球重悬于10mL的磷酸缓冲溶液中；用碳酸钠缓冲液将另一株鼠抗人HE4单克隆抗体稀释成1mg/mL，并用碳酸钠缓冲液室温(25℃±5℃)避光搅拌1-5h(优选2小时)后透析；吸取0.5-5mL(优选1mL)抗体并加入10mL磁性微球的磷酸缓冲溶液中，室温震荡8h，用磁铁将磁性微球吸于一侧，PBS洗涤3次，洗涤后分散在10mL的磷酸缓冲溶液中即可。其中采用优选方案的标记效果更好、更稳定。
4.检测过程如下：
(1)将10-100μL(优选25μL)含有HE4的待测样本、10-150μL(优选100μL)的生物素标记的一株鼠抗人HE4单克隆抗体和10-150μL(优选50μL)磁性微球标记另一株鼠抗人HE4单克隆抗体加入到反应池中，经过3-90min(优选15min)的温育反应，形成一端标记有磁性微球材料、另一端标记有生物素的HE4免疫复合物；
(2)然后向步骤(1)反应后的混合物中加入10-100μL(优选50μL)表面标记有链酶亲和素的纳米氧化铜，标记在HE4免疫复合物一端的生物素与纳米氧化铜表面的链酶亲和素进行特异性结合，形成表面结合了一端标记有纳米氧化铜的HE4免疫复合物的磁性微球；
(3)采用磁分离的方式将步骤(2)中表面结合了HE4免疫复合物的纳米微球固定到工作电极表面，然后移除反应池中的剩余液体，并加注25-1000μL(优选100μL)柠檬酸电解液；
(4)采用四电极体系进行测定，将工作电极(石墨电极)、内控电极(玻碳电极)、对电极(铂电极或碳电极)和参比电极(Ag/AgCl电极)的丝网印刷电极进行电化学检测。先将内控电极、对电极和参比电极连接到电化学工作站上，测定基体的伏安曲线图，进行基数校准，然后再将工作电极、对电极和参比电极连接到电化学工作站上，利用伏安法测定磁性微球表面的免疫复合物上的纳米氧化铜进行还原反应的伏安曲线图，然后在测得的伏安曲线图中找出铜离子的特征峰，计算半峰面积，用半峰面积与HE4浓度之间用Log-Log线性回归方程或四参数方程(优选四参数方程)进行拟合制备HE4标准曲线，通过标准曲线计算HE4的含量。
其中采用上述各步骤中的优选方案，检测的灵敏度更高、稳定性更好。
5.标准曲线的建立：
配置浓度为0、1、10、40、200、1000pmol/L的的HE4校准品用于建立HE4标准曲线，检测灵敏度为0.2pmol/L，检测范围为1～1000pmol/L，检测数据如表9所示，标准曲线如图11所示。
表9检测数据
6.与罗氏结果对比：
采用本发明中的方法和罗氏电化学发光法对20例样本进行检测，检测结果如表10所示，对检测结果进行相关性分析如图12所示，回归方程为y＝0.9483x+3.1147，R2＝0.9811，表明本方法与罗氏的电化学发光法具有良好的相关性。
表10本方法与罗氏电化学方法的检测结果对比
实施例6：以25-羟基维生素D(25-OH-D)为例(竞争法)
1.纳米氧化铜标记链霉亲和素：
先用PBS缓冲液将链霉亲和素稀释成1mg/mL，并用PBS缓冲液室温(25℃±5℃)避光搅拌4小时进行透析备用；在1-10mL(优选3mL)(质量分数1g/100mL，纯度99.9％)制备的纳米氧化铜(1-100nm，优选30-40nm)材料中加入1mL链霉亲和素溶液，在25℃±5℃下避光磁力搅拌30min，然后在10000r/min条件下离心5-30min(优选15min)去除上清液，随后用含1-10％(优选10％)BSA 10mL复溶后封闭1-5h(优选3h)。然后在3000-8000r/min(优选5000r/min)条件下离心5-30min(优选20min)，最后取出上清液2-8℃保存即可。工作液以PBS缓冲液稀释100-5000倍备用(优选100)。其中采用优选方案的标记效果更好、更稳定。
2.生物素标记25-OH-D完全抗原：
先用碳酸钠缓冲液将25-OH-D完全抗原稀释成1mg/mL，并用碳酸钠缓冲液室温(25℃±5℃)避光搅拌1-5h(优选4小时)后透析；随后用N,N-二甲基酰胺(DMF)将6–氨基己酸-N羟基琥珀酰亚胺-生物素(BCNHS)配置成1mg/mL；在1mL的25-OH-D完全抗原溶液中加入上述DMF溶液10-160μL(优选80μL)，玻璃瓶中混合，室温(25℃±5℃)避光搅拌1-5h(优选2小时)；加入1mol/L氯化铵溶液5-20μL(优选9.6μL)，室温(25℃±5℃)避光搅拌10分钟；然后混合溶液转入透析袋，用磷酸缓冲液4℃透析过夜。最后取出加等量甘油-20℃保存即可。工作液以PBS缓冲液稀释100-5000倍备用(优选300)。其中采用优选方案的标记效果更好、更稳定。
3.一株鼠抗人25-OH-D单克隆抗体标记的磁性微球：
取0.5mL，2.5mg/mL磁性微球(粒径为300nm-3000nm，优选800nm，购自西格玛)用磷酸缓冲溶液(pH＝7.4)洗涤2次后重悬于10mL的磷酸缓冲溶液中，继续加入4mL的戊二醛室温震荡反应10h，反应结束后用纯化水进行洗涤2～3次，将磁性微球重悬于10mL的磷酸缓冲溶液中；用碳酸钠缓冲液将鼠抗人25-OH-D单克隆抗体稀释成1mg/mL，并用碳酸钠缓冲液室温(25℃±5℃)避光搅拌1-5h(优选2小时)后透析；吸取0.5-5mL(优选1mL)抗体并加入10mL磁性微球的磷酸缓冲溶液中，室温震荡8h，用磁铁将磁性微球吸于一侧，PBS洗涤3次，洗涤后分散在10mL的磷酸缓冲溶液中即可。其中采用优选方案的标记效果更好、更稳定。
4.检测过程如下：
(1)将10-100μL(优选25μL)含有25-OH-D的待测样本先用结合蛋白释放剂添加25μL处理10min，随后加10-150μL(优选100μL)的生物素标记的25-OH-D完全抗原和10-150μL(优选50μL)磁性微球标记一株鼠抗人25-OH-D单克隆抗体加入到反应池中，经过3-90min(优选15min)的温育反应，待测物样本中的25-OH-D、生物素标记的25-OH-D完全抗原竞争与一株鼠抗人25-OH-D单克隆抗体发生免疫反应，形成磁性微球表面结合待测样本中25-OH-D的免疫复合物I和结合生物素标记的一株25-OH-D完全抗原的免疫复合物II；
(2)然后向步骤(1)反应后的混合物中加入10-100μL(优选50μL)表面标记有链酶亲和素的纳米氧化铜，标记在25-OH-D免疫复合物II一端的生物素与纳米氧化铜表面的链酶亲和素进行特异性结合，表面结合了25-OH-D免疫复合物的磁性微球；
(3)采用磁分离的方式将步骤(2)中表面结合了免疫复合物的纳米微球固定到工作电极表面，然后移除反应池中的剩余液体，并加注25-1000μL(优选100μL)柠檬酸电解液；
(4)采用四电极体系进行测定，将工作电极(铅电极)、内控电极(金微电极)、对电极(铂电极或碳电极)和参比电极(Ag/AgCl电极)的丝网印刷电极进行电化学检测。先将内控电极、对电极和参比电极连接到电化学工作站上，测定基体的伏安曲线图，进行基数校准，然后再将工作电极、对电极和参比电极连接到电化学工作站上，利用伏安法测定磁性微球表面的免疫复合物上的纳米氧化铜还原反应的伏安曲线图，然后在测得的伏安曲线图中找出铜离子的特征峰，计算半峰面积，用半峰面积与25-OH-D浓度之间用Log-Logit线性回归方程或四参数方程(优选四参数方程)进行拟合制备25-OH-D标准曲线，通过标准曲线计算25-OH-D的含量。
其中采用上述各步骤中的优选方案，检测的灵敏度更高、稳定性更好。
5.标准曲线的建立：
配置浓度为0、0.5、2.5、10、50、200ng/mL的的25-OH-D校准品用于建立25-OH-D标准曲线，检测灵敏度为0.2ng/mL，检测范围为0.5～200ng/mL，检测数据如表11所示，标准曲线如图13所示。
表11检测数据
6.与罗氏结果对比：
采用本发明中的方法和罗氏电化学发光法对20例样本进行检测，检测结果如表12所示，对检测结果进行相关性分析如图14所示，回归方程为y＝0.9884x+0.3127，R2＝0.9595，表明本方法与罗氏的电化学发光法具有良好的相关性。
表12本方法与罗氏电化学法检测结果对比
实施例7CuO作为标记材料与Cu2+负载于聚苯乙烯微球上作为标记材料的稳定性比较
(1)Cu2+负载于聚苯乙烯(PS)微球上作为材料标记一株鼠抗人PCT单克隆抗体，标记完成后，用于测定5ng/mL的PCT校准品，测定的Cu2+发生还原反应的伏安曲线图如图15所示中的a线，在靠近0V的地方产生了较高的还原峰信号；然后将Cu2+负载于PS微球上标记的一株鼠抗人PCT单克隆抗体于37℃下放置3天，然后用于测定5ng/mL的PCT校准品，测定的Cu2+发生还原反应的伏安曲线图如图15所示中的b线，几乎没有发现Cu2+发生还原反应的峰，表明Cu2+负载于聚苯乙烯(PS)微球上作为标记材料的稳定性较差，这可能是由于PS微球表面的Cu2+随着放置时间的延长，发生脱落导致的。
(2)采用CuO作为标记材料标记一株鼠抗人PCT单克隆抗体，标记完成后，用于测定5ng/mL的PCT校准品，测定的CuO发生还原反应的伏安曲线图如图16所示中的a线；然后将CuO标记的一株鼠抗人PCT单克隆抗体于37℃下放置3天，然后用于测定5ng/mL的PCT校准品，测定的CuO发生还原反应的伏安曲线图如图16所示中的b线，从图中可以看出检测结果差不多，表明CuO作为标记物具有较好的稳定性；除此之外，Cu2+在溶液中是以离子状态存在，作为标记材料时需要先负载与载体(例如PS微球、铂微球、SiO2微球)上，然后对待测物抗体或抗原进行标记，过程复杂；而CuO在溶液中是以纳米小颗粒存在于溶液中，可以直接用于待测物抗体或抗原的标记，简化操作过程。
实施例8氧化铜中Cu2+还原峰与氧化锌中Zn2+还原峰受H+还原峰的影响对比
(1)采用CuO作为标记材料标记一株鼠抗人PCT单克隆抗体，标记完成后，用于测定25ng/mL的PCT校准品，测定的CuO发生还原反应的伏安曲线图如图17所示，图中a处为CuO中Cu2+的还原峰，几乎不受b处可能存在的H+还原峰的影响；
(2)采用ZnO作为标记材料标记一株鼠抗人PCT单克隆抗体，标记完成后，用于测定25ng/mL的PCT校准品，测定的ZnO发生还原反应的伏安曲线图如图18所示，图中a处为ZnO中Zn2+的还原峰，受b处可能存在的H+还原峰的影响较大，进而对检测结果产生较大的影响。
实施例9内控电极的作用
采用CuO作为标记材料标记一株鼠抗人PCT单克隆抗体，标记完成后，用于测定5ng/mL的PCT校准品，采用内控电极先进行基数校准后再测定作为标记材料的CuO还原反应的伏安曲线图如图19所示中的a线，扣除本底的干扰，峰形规整，能够有较小的误差，提高检测的准确性；为采用内控电极进行基数校准而是直接测定作为标记材料的CuO还原反应的伏安曲线图如图19所示中的b线，CuO中铜离子的还原峰受本底的影响，峰形不太规整，可能会使检测结果存在较大误差。
附：所需溶液配制
(1)PBS缓冲溶液
(2)碳酸钠缓冲溶液
碳酸钠 4.33g
碳酸氢钠 2.96g
纯化水定容至 1000mL；
(3)磷酸缓冲溶液
磷酸二氢钠0.99g
磷酸氢二钠5.16g
纯化水定容至1000mL；
(4)柠檬酸电解液
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本专利涵盖范围之内。
机译： 涂覆的乳胶颗粒，其制备方法及其在免疫复合物估算中的应用，并可以分析该复合物的成分
机译： 一种使用至少一种标记的成分在测试样品中确定特异性结合蛋白与相应可结合物质之间反应的一种或多种成分的方法，一种标记的成分的制备方法以及一种测定免疫成分
机译： 碘标记的放射性雌激素衍生物，其制备方法及其在放射免疫分析中的应用
