基于贵金属纳米粒子标记技术的均相免疫分析新方法研究

摘要

免疫分析利用抗体-抗原间的特异性结合反应对蛋白质、药物、激素、毒素、微生物等物质进行高选择性、高亲和性定性定量检测,已被广泛应用于临床医学、化学、药学等领域。传统的免疫分析方法如酶联吸附免疫方法(ELISA)大多采用非均相模式,操作繁琐,分析时间长,需要抗体的包埋,多次洗涤和显色等步骤。难以满足某些快速检测的要求。金纳米粒子(GNPs)易于合成与修饰,具有生物相容性好、光散射特性高等优点,是一种优异的光学标记探针。共振光散射相关光谱(RLSCS)是一种高灵敏度的单颗粒探测方法,该方法基于贵重金属纳米粒子在高聚焦的微区内由于布朗运动会产生散射光光强波动,通过对波动进行自相关分析可获取微区内粒子浓度、扩散系数等信息。
　　本文将单颗粒检测方法与贵金属纳米粒子(如金和银纳米粒子)标记技术结合,发展了一些灵敏的均相免疫分析新方法。本论文研究工作主要包括:
　　1)本文将RLSCS检测方法和金纳米粒子标记技术结合,构建了肝癌标志物甲胎蛋白(AFP)的均相夹心免疫分析新方法。该方法将AFP的两种抗体通过共价键的形式连接到GNPs上,形成金标抗体探针。当两种抗体探针与含有抗原的样品溶液混合,夹心免疫反应使GNPs聚集形成二聚或者多聚体,导致溶液中GNPs的特征扩散时间的变化,能够被RLSCS灵敏地检测到。研究结果表明GNPs的特征扩散时间与抗原浓度的对数值呈线性相关。系统地研究各种因素对检测的影响。在优化的条件下,AFP线性范围为1 pmol/L-1 nmol/L,检测下限为1 pmol/L。将该方法成功地用于人血清中AFP含量的测定,其结果与ELISA法一致。与传统方法相比,该方法操作简单、分析快速、灵敏度高、选择性好,耗样量小。
　　2)竞争免疫模式可同时适用于大分子和小分子的分析。银纳米粒子(SNPs)作为探针载体具有比GNPs更高的光散射强度。将高灵敏的RLSCS方法与银纳米粒子(SNPs)标记技术相结合,建立了均相竞争免疫分析新方法,用于小分子-雌二醇(E2)和大分子-甲胎蛋白(AFP)分析。此方法将E2抗体和AFP的抗体、抗原通过共价的形式包覆在SNPs表面,E2的半抗原(雌二醇与牛血清白蛋白连接物,BSA-E2)以静电吸附作用连接在SNPs上。当含有E2或AFP的样品溶液与过量的包覆了抗体的SNPs溶液混合,通过免疫反应SNPs@Ab上的一部分位点将被占据,再加入AFP抗原和E2半抗原连接的SNPs,使其占据剩下的位点,同时形成二聚或多聚的免疫产物。溶液中SNPs的特征扩散时间将发生变化,而这种变化能够灵敏的被RLSCS检测到。研究结果表明SNPs的特征扩散时间与E2和AFP加入浓度的对数值呈线性相关。系统地研究了各种因素对检测的影响。在优化的条件下,E2的检测线性范围为10 pmol/L-1 nmol/L,检测下限为10 pmol/L;AFP的检测线性范围为100 pmol/L-10 nmol/L,检测下限为100 pmol/L。将该方法用于人尿液中 E2含量和人血清中 AFP含量的测定,其结果与传统的ELISA方法所得的结果基本吻合。本法具有灵敏度高、操作简单、分析时间短、普适性强等优点,在临床诊断、食品安全检测和环境分析等方面具有广阔应用前景。
　　3) GNPs溶液受到激光照射可产生强烈的共振散射光子爆发,光子爆发个数与溶液中GNPs粒子个数呈良好的线性关系。基于检测基线噪声满足高斯分布、纳米粒子光子爆发信号满足泊松分布的特征,发展了光子爆发纳米粒子计数方法。对光子爆发的强度与相应强度下光子爆发个数作图,得到光子爆发强度与个数的关系,通过曲线拟合确定光子爆发的噪声分布区间及其数学期望μ和方差σ,设定阈值=μ+8×σ。通过软件得到光子爆发峰的个数。此方法重现性好、灵敏度高。
　　4)基于光子爆发计数技术,发展了均相免疫分析新方法。分别建立了前列腺特异抗原(PSA)和甲胎蛋白(AFP)的夹心和竞争免疫分析方法。其方法的原理类似于散射相关光谱方法,采用金纳米粒子标记抗体或抗原。在夹心免疫分析中,免疫反应后GNPs会形成一些二聚或者低聚体,导致了溶液中粒子数目减少,进而引起光子爆发数目减少,这一变化可以通过光子爆发计数检测技术灵敏的表征。我们对构建的四种分析体系进行了系统的优化。其中所得 PSA夹心免疫分析的最优条件为以680 pmol/L的20 nm GNPs为探针进行实验,线性范围为1 pmol/L-10 nmol/L,检测下限为1 pmol/L;PSA竞争免疫分析的最优条件为以1.36 nmol/L的20 nm GNPs为探针进行实验,线性范围为10 pmol/L-10 nmol/L,检测下限为10 pmol/L;AFP夹心免疫分析的最优条件为以340 pmol/L的40 nm GNPs为探针进行实验,线性范围为1 pmol/L-10 nmol/L,检测下限为1 pmol/L;AFP竞争免疫分析的最优条件为以170 pmol/L的20 nm GNPs为探针进行实验,线性范围为1 pmol/L-1 nmol/L,检测下限为1 pmol/L。最后以优化后的系统对实际样品(血清)中PSA和AFP含量进行了定量检测。实验结果与传统的ELISA方法结果基本吻合。此方法的灵敏度高、选择性好、样品处理简单,是一种具有发展潜力的分析检测新方法。该方法与RLSCS方法相比,重现性得到了一定的改善。

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第一章 绪论

1.1引言

1.2 免疫分析

1.3 共振光散射相关光谱(RLSCS)原理与应用

1.4 散射光光子爆发计数原理与应用

1.5 本论文的选题思路与研究内容

参考文献

第二章 基于散射相关光谱均相夹心免疫分析新方法研究

2.1 引言

2.2 实验部分

2.3结果与讨论

2.4本章小结

参考文献

第三章 基于散射相关光谱的均相竞争免疫分析新方法研究

3.1 引言

3.2实验部分

3.3结果与讨论

3.4本章小结

参考文献

第四章 金纳米粒子光子爆发计数方法研究

4.1 引言

4.2 实验部分

4.3 结果与讨论

4.4 本章小结

参考文献

第五章 基于光子爆发计数的免疫分析新方法构建与应用

5.1 引言

5.2 实验部分

5.3 结果与讨论

5.4 本章小结

参考文献

第六章 全文总结

符号与标记

致谢

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