一株具有降解芳香化合物、除氮、除砷能力的氢噬胞菌H7及用途

摘要

本发明属于环境微生物应用技术领域，具体涉及一株具有降解芳香化合物、除氮、除砷能力的氢噬胞菌H7及用途。该噬胞菌H7菌株属于氢嗜噬胞菌属(Hydrogenophaga sp.)，该菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2018149。本发明的砷氧化菌氢噬胞菌H7为一株能降解3‑羟基苯甲酸，4‑羟基苯甲酸，苯甲酸和苯酚等多种芳香化合物的砷氧化细菌，该菌株不仅可以将毒性高的As

说明书

技术领域

本发明属于环境微生物应用技术领域，具体涉及一株一株具有降解芳香化合物、除氮、除砷能力的氢噬胞菌H7及用途。所述的菌株能降解3-羟基苯甲酸和4-羟基苯甲酸等芳香化合物，能将高毒的三价砷氧化成低毒的五价砷以及能将硝酸盐还原为氮气的氢噬胞菌H7在净化砷和芳香化合物复合污染方面及在净化氮污染。

背景技术

目前许多污染区并不是单一类型的污染，而是重金属和有机污染物等的复合污染。砷和芳香化合物作为重金属和有机污染物的典型代表，常被同时发现。砷(As)是一种剧毒类金属，对人体和环境都有极大的伤害，而许多芳香化合物具有致畸、致癌和致突变作用。这两者的来源除天然因素外，主要还是人为因素，例如矿的开采和冶炼、砷产品的加工、煤、石油、木材及有机高分子化合物的不完全燃烧时都能产生芳香化合物，这些对土壤、地下水及河流造成了严重的污染。因此对这种复合污染的治理迫在眉睫。

在自然界砷主要以亚砷酸盐As(III)和砷酸盐As(V)的形式存在。由于重金属不能被降解，只能被转化，砷氧化菌能将毒性强的As(III)氧化成毒性低的As(V)，有利于砷污染环境和细菌自身的解毒，且As(V)带负电荷，易与物理化学方法结合而被去除。目前，去除砷污染的主要方法有化学沉淀法，物理吸附法，植物修复法和微生物活性污泥法等。化学沉淀法可以利用铁离子等沉淀As(V)，其效果明显但是对高毒的As(III)几乎没有效果；物理吸附法费用高不利于大规模净化；植物修复法某些植物(如蜈蚣草)可以吸收高浓度的砷并富集在体内，大量种植收集后恰当处理，此法不适宜大量含砷污水的治理；微生物活性污泥法将培养的微生物加入曝气池混合液以达到代谢和吸附重金属离子的目的，此法经济高效且无害，但此法主要是针对带电荷的As(V)有去除作用，而对毒性更强的不带电荷的As(III)作用不大，因此如果要去除毒性更大的As(III)，则需将As(III)氧化成As(V)，若在活性污泥总加入氧化剂，会影响活性污泥的活性。因此具有砷氧化能力的微生物在治理砷污染方面有其独特的优势。

芳香化合物是一类碳水化合物，被广泛用于化工，石油，医药，农药等生产工业。目前，处理芳香化合物污染的方法主要有化学氧化法、土壤气提/生物气提和微生物降解法等。化学氧化法虽然效率高，速度快，但是成本高且易破坏土壤结构；土壤气提/生物气提主要针对挥发性好的有机物；微生物降解法是指某些微生物能以芳香化合物为碳源和能源进行生长从而到达将其降解的目的，此法安全可靠且修复成本低。

目前，关于砷和芳香化合物复合污染的修复方法报道较少，主要有淋洗萃取法和植物修复法。前者易带来二次污染和导致土壤肥力下降；后者易受土壤类型和气候等限制，且修复周期长以及不适宜水污染的治理，且主要还是以去除砷污染为主。从目前的报道可知，砷和芳香化合物的单一污染均可采用基于微生物的方法进行治理，且微生物处理法有其独特的优点，但是，目前关于既能转化高毒的三价砷又能降解芳香化合物的微生物几乎没有报道。因此，既能转化重金属砷又能降解芳香化合物的微生物在其复合污染治理中具有重要的应用价值。

经研究，本发明的氢噬胞菌H7是一株能降解3-羟基苯甲酸，4-羟基苯甲酸，水杨酸，苯甲酸和苯酚等多种芳香化合物的砷氧化细菌(本发明中涉及的芳香化合物降解试验以3-羟基苯甲酸和4-羟基苯甲酸为例)，其不仅可以将毒性高的As(III)氧化成毒性低的As(V)，还可以降解3-羟基苯甲酸和4-羟基苯甲酸等芳香化合物，因此菌株H7在以上两种类型污染物的复合污染区具有巨大的应用潜能。

此外，氢噬胞菌H7是一株具有反硝化能力的细菌，其能将硝酸盐依次还原为亚硝酸盐，一氧化氮，一氧化二氮，最后还原为氮气以到达除氮的目的。目前，氮污染主要包括氨氮污染，硝酸盐污染和亚硝酸盐污染，氮污染不仅危及人类健康，对生物多样性和臭氧均有危害。目前处理三氮污染最常用的方法之一就是基于微生物的方法，首先可利于硝化细菌将氨氮氧化为硝酸盐，然后在反硝化细菌的作用下将硝酸盐依次还原亚硝酸盐，一氧化氮，一氧化二氮，氮气从而去除污染环境中的氮。因此具有反硝化能力的氢噬胞菌H7不仅在砷和芳香化合物复合污染方面具有巨大的应用潜能，其在氮污染的去除方面也具有潜在的应用价值。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术及微生物资源缺乏缺陷，分离得到一株既能降解3-羟基苯甲酸，4-羟基苯甲酸，水杨酸，苯甲酸和苯酚等芳香化合物又能将高毒的As(III)氧化成低毒的As(V)，此外还具有反硝化能力的氢噬胞菌H7,通过应用净化环境中的砷和芳香化合物的复合污染以及氮污染。本发明还涉及其用途。

本发明通过以下技术方案实现：

本发明人从中国湖北省大冶市某铜铁矿表层土壤样品中分离、筛选得到一株新型砷氧化菌，能将高毒的As(III)氧化成低毒的As(V)，到达环境和菌株自身解毒的目的，同时还能降解3-羟基苯甲酸，4-羟基苯甲酸，水杨酸，苯甲酸和苯酚等芳香化合物，此外还能将硝酸盐依次还原为氮气以达到除氮的目的。该菌株属于氢噬胞菌属(Hydrogenophagasp.)。申请人将该菌株命名为氢噬胞菌H7，Hydrogenophaga sp.H7，于2018年3月23日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO:M2018149。

氢噬胞菌H7的筛选的技术流程参见图1。由图1所示，本发明先采集中国湖北省大冶市某铜铁矿表层土壤样品，加一定浓度(见后面的详细描述)As(III)进行富集培养，再对富集培养的土样进行稀释并涂布含有100μM亚砷酸钠的MMNH₄(Minimal>4法(T.M.Salmassi>

本发明的积极效果：

As(III)的毒性强于As(V)，前者不带电荷、不易被去除、具有很强的移动性、更易危害环境，而后者带电荷，移动性差，易与化学等方法结合而被去除。许多芳香化合物具有致畸、致癌和致突变作用。两种污染物对环境和人体都具有极大的危害。本发明筛选到的氢噬胞菌H7可以将毒性高的As(III)氧化为低毒的As(V)且能够降解3-羟基苯甲酸和4-羟基苯甲酸等芳香化合物,可以极大降低环境中砷和芳香化合物的危害。此外，通过生理生化实验，鉴定氢噬胞菌H7能还原硝酸盐和亚硝酸盐以达到除氮的目的。氢噬胞菌H7不仅有望在净化砷和芳香化合物复合污染方面发挥重要作用，其在氮污染治理方面也具有潜在应用价值(见表1)。

表1本发明与CN200710052064，CN201710811304，CN200710157904和CN201310100699文献相比具有的积极效果

目前，能降解芳香化合物又能将高毒的As(III)氧化为低毒的As(V)的微生物几乎没有报道，将本发明与已申请专利的具有砷氧化表型或能降解芳香化合物或能降低化学需氧量(COD)或具有反硝化能力的菌株进行比较，其对比效果如表1所示。

附图说明

图1：本发明的技术路线图。

图2：本发明的氢噬胞菌H7的扫描电镜照片。放大倍数和比例尺在图中已标明。

图3：本发明的氢噬胞菌H7在1/10ST培养基中的砷氧化曲线图及3-羟基苯甲酸和4-羟基苯甲酸降解曲线图。附图标记说明：图3中的A图和C图分别为在加3-羟基苯甲酸和4-羟基苯甲酸条件下的砷氧化曲线；图3中的B图和D图分别为在加As(III)条件下的3-羟基苯甲酸和4-羟基苯甲酸的降解曲线。

图4：本发明的氢噬胞菌H7在1/10ST培养基中的硝酸盐还原曲线图。

图5：本发明的氢噬胞菌H7在灭菌和不灭菌湖水(取自武汉市南湖)中培养的砷氧化曲线图及3-羟基苯甲酸和4-羟基苯甲酸降解曲线图。附图标记说明：图4中的A图和C图分别为在灭菌的湖水中加3-羟基苯甲酸和4-羟基苯甲酸条件下的As(III)氧化曲线；图4中的B图和D图分别为在灭菌的湖水中加As(III)条件下的3-羟基苯甲酸和4-羟基苯甲酸的降解曲线；E和G分别为在不灭菌的湖水中加3-羟基苯甲酸和4-羟基苯甲酸条件下的As(III)氧化曲线；图4中的F图和H图分别为在不灭菌的湖水加As(III)条件下的3-羟基苯甲酸和4-羟基苯甲酸的降解曲线。

图6：在灭菌和不灭菌的湖水中加入As(III)，3-羟基苯甲酸和4-羟基苯甲酸，及加氢噬胞菌H7和不加氢噬胞菌H7的化学需氧量COD含量变化图。附图标记说明：图5中的A图是湖水中加入As(III)和3-羟基苯甲酸的COD含量变化图；图5中的B图是湖水中加入As(III)和4-羟基苯甲酸的COD含量变化图。

具体实施方式

实施例1：从湖北大冶金矿土壤中分离得到氢噬胞菌H7

(1)样品采取：2010年5月采集中国湖北省大冶市某铜铁矿的表层土壤。

(2)样品富集：精确称取土样100g于250mL灭菌三角瓶中，加5mL 80mM的亚砷酸钠NaAsO₂(As(III))，轻轻搅匀置28℃温箱中培养一周，注意补加无菌水，确保样品不干。

(3)砷抗性菌分离：精确称取As(III)富集土样10g于装有90mL无菌生理盐水的三角瓶中，置28℃摇床中振荡半小时，再依次取1mL到9mL无菌生理盐水中逐步稀释至10^-3、10^-4、10^-5，分别取0.1mL涂布含400μM>4固体培养基平板，每个稀释度涂布3个平板，置28℃温箱中培养一周，长出的菌株为砷抗性菌，将平板置4℃冰箱中待用。MMNH₄液体培养基配方如下(以100mL计)：甘露醇1g，NH₄Cl>2HPO₄·3H₂O>2PO₄>2SO₄>2SO₄>3·6H₂O1g，CaCl₂·2H₂O>2·6H₂O>4固体培养基的成分同液体培养基成分，只是固体培养基需额外添加1.5％的琼脂。

(4)划线分离：将步骤(3)中得到的砷抗性菌挑取不同的菌落划线，确保得到单克隆，划线用R2A培养基平板，待菌长出后放4℃冰箱并用甘油冷冻管保存一份于-80℃冰箱。R2A培养基配方如下(以1L计)：酵母粉0.5g，可溶性淀粉0.5g，蛋白胨0.5g，磷酸氢二钾0.3g，酪蛋白氨基酸0.5g，丙酮酸钠0.3g，葡萄糖0.5g，MgSO₄·7H₂O>

(5)砷氧化菌的筛选：将步骤(4)中得到的砷抗性菌单克隆转接到MMNH₄液体培养基中，补加As(III)，使其终浓度至400μM，置28℃摇床中振荡培养，待菌长浓后用KMnO₄检测其氧化性。具体步骤如下，取10μL>4到1.5mL离心管中，再补加1mL上述培养的MMNH₄菌液，若KMnO₄由粉红色变为橙色说明没有氧化，若KMnO₄仍为粉红色说明发生氧化(KMnO₄可以将As(III)氧化为As(V)，菌液中如存在As(III)，则KMnO₄发生反应变色)。

(6)降解芳香化合物的砷氧化菌的筛选：将步骤(5)中得到的砷氧化菌单克隆转接到1/10ST培养基中，额外添加50mg/L的芳香化合物如苯甲酸，羟基苯甲酸，苯酚和菲等作为碳源，筛选能降解芳香化合物的砷氧化菌。1/10ST培养基配方如下：0.5g/L蛋白胨和0.05g/L酵母粉。在121℃高压蒸汽下灭菌15min。

(7)降解芳香化合物的砷氧化菌的分类鉴定：一是利用16S rDNA鉴定，即采用原核生物16SrDNA通用引物27F(5'AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3')和1492R(5'GGYTACCTTGTTACGACTT3')做PCR(具体PCR方法参见申请人的专利文献，专利号为2005101205847，发明名称为“一种土壤总DNA小量快速提取方法”)。扩增其16S rDNA并测序，再与NCBI GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)核苷酸数据库比对，核苷酸同源性为99％，故鉴定为氢噬胞菌H7(Hydrogenophaga sp.H7)。二是利用扫描电镜进行形态鉴定(见图2)和革兰氏染色分析和生长特性鉴定。氢噬胞菌H7特征为：菌体杆状、长1.0-2.2μm、宽0.5-0.8μm、革兰氏阴性菌、适宜生长温度15-37℃、适宜pH 5.0-10.0、兼性好氧、在R2A培养基中菌落为黄色圆形、氧化酶活性和β-半乳糖苷酶为阳性、过氧化氢酶活性为阴性，此外利用锌粉检测法鉴定其具还原硝酸盐和亚硝酸盐能力即具有反硝化能力；三是砷氧化酶基因，芳香化合物降解基因和参与反硝化基因的鉴定。接种氢噬胞菌H7于MMNH₄液体培养基中，补加40μL>

氢噬胞菌H7菌株的保藏方法：

氢噬胞菌H7可以在R2A、1/10ST或MMNH₄液体或固体培养基上在28℃培养，培养后可在4℃下作短期保藏。若长期保藏，可使用甘油冷冻管或冷冻干燥管(参见：赵斌，何绍江。微生物学实验.第一版.科学出版社.2002：P202－205)保藏菌株比较合适。

实施例2：氢噬胞菌H7的砷氧化曲线及3-羟基苯甲酸和4-羟基苯甲酸降解曲线及硝酸盐还原曲线

挑取氢噬胞菌H7单克隆接种到100mL的R2A液体培养基，于28℃摇床中振荡培养至OD₆₀₀为0.45左右，将其作为种子液，以1％体积的接种量接种于新鲜的100mL>600<0.01)，并向培养基中添加40μL>

此外，挑取氢噬胞菌H7单克隆接种到100mL的R2A液体培养基，于28℃摇床中振荡培养至OD₆₀₀为0.45左右，将其作为种子液，以3％体积的接种量接种于新鲜的15mL>3，使其终浓度至100mg/L。将其置于28℃培养箱中静止培养。每隔12小时取一次样。每次分别测硝酸盐(NO₃^-)和亚硝酸盐(NO₂^-)的浓度。硝酸盐和亚硝酸盐利用高效液相色谱法(HPLC)测定。具体做法如下：取100μL的样12000rpm离心2分钟后，取上清，然后在样品上清中加入5％0.2mol/LNH₄Cl-NH₃缓冲液(pH>2PO₄-H₃PO₄缓冲液(pH>

由图3可以看出，在同时加有400μM As(III)和250mg/L 3-羟基苯甲酸1/10ST培养基中，菌株H7能24小时内完全氧化400μM(见图3中的A图)和同时在20小时完全降解250mg/L3-羟基苯甲酸(见图3中的B图)；同理，在同时加有400μM As(III)和250mg/L 4-羟基苯甲酸1/10ST培养基中，菌株H7能20小时内完全氧化400μM(见图3中的C图)和同时在16小时完全降解250mg/L 3-羟基苯甲酸(见图3中的D图)。

由图4可以看出，前24小时，培养液中的NO₃^-浓度逐渐减少，而NO₂^-浓度逐渐增加，说明在这个时间段内，硝酸盐一直被还原为亚硝酸盐。24小时后，亚硝酸盐的浓度也逐渐减少直至48小时几乎为零，说明亚硝酸盐在培养液中继续被还原而形成气态氮。

利用HPLC-HG-ASF，紫外分光光度计和HPLC方法测定，1/10ST培养基本身不能氧化As(III)，降解3-羟基苯甲酸，4-羟基苯甲酸以及还原硝酸盐和亚硝酸盐。

实施例3：氢噬胞菌H7在模拟复合污染水体中对三价砷氧化效果及3-羟基苯甲酸和4-羟基苯甲酸的降解效果以及降低化学需氧量COD的效果

采用中国湖北省武汉市华中农业大学旁南湖的湖水(该湖水为淡水，采样点的化学需氧量COD为9.040±0.238，pH为7.0左右)加As(III)和3-羟基苯甲酸或加As(III)和4-羟基苯甲酸用来模拟砷和3羟基苯甲酸或砷和4-羟基苯甲酸复合污染水体，考察氢噬胞菌H7对As(III)的氧化效果及对3-羟基苯甲酸和4-羟基苯甲酸的降解效果。具体步骤如下：准备两个250mL三角瓶，一个装100mL湖水(在121℃，高压蒸汽下灭菌20min)，另一个三角瓶也装100mL湖水(不用高压蒸汽灭菌)，然后每瓶补加氢噬胞菌H7的培养菌体，种子液OD₆₀₀为0.45左右，接种量为1％。再分别向2个三角瓶中补加As(III)母液，使其终浓度至400μM，同时向培养基中分别加入3-羟基苯甲酸和4-羟基苯甲酸，使其终浓度至250mg/L，置28℃摇床中振荡培养。每隔4小时取一次样测As(III)氧化曲线及3-羟基苯甲酸和4-羟基苯甲酸降解效果。此外，按照上面所述设置同样的试验组，额外加入对照试验组：准备两个250mL三角瓶，一个装100mL湖水(121℃，高压蒸汽灭菌20min)，另一个三角瓶也装100mL湖水(不灭菌)，分别加入400μM>

由图5可以看出，无论是在灭菌的湖水还是在不灭菌的湖水中，本发明分离的菌株H7均能氧化As(III)，且能降解3-羟基苯甲酸和4-羟基苯甲酸。菌株H7在加有As(III)和3-羟基苯甲酸的体系中，其在灭菌的湖水中4小时内能完全氧化400μM As(III)(见图5中的A图)；在不灭菌的湖水中，其能在12小时能完全氧化400μM As(III)(见图5中的E图)；在这两种体系中，菌株H7均能在28小时内完全降解250mg/L的3-羟基苯甲酸，且其降解速率无太大区别(见图5中的B图和图5中的F图)。同理，菌株H7在加有As(III)和4-羟基苯甲酸的体系中，其在灭菌的和不灭菌的湖水中，均能在12小时能完全氧化400μM As(III)(见图5中的C图和图5中的G图)且均能在28小时内完全降解250mg/L的4-羟基苯甲酸，且其降解速率无太大区别(见图5中的D图和图5中的H图)。

由图6可以看出，在不加菌株H7的条件下，无论是湖水灭菌还是湖水不灭菌(湖水灭菌和湖水不灭菌)，化学需氧量COD含量较起始变化不大，而在加菌株H7条件下(湖水灭菌+H7菌株和湖水不灭菌+H7菌株)，其COD含量较起始均有明显降低。其中，在加As(III)和3-羟基苯甲酸体系中，若湖水灭菌，48小时后其COD含量较起则始降低了69.08％(见图6中的A图，湖水灭菌+H7菌株)；若湖水不灭菌，48小时后其COD含量较起始降低了40.12％(图5中的A图湖水不灭菌+H7菌株)。同理，在加As(III)和4-羟基苯甲酸体系中，若湖水灭菌，48小时后其COD含量较起则始降低了85.53％(见图6中的B图，湖水灭菌+H7菌株)；若湖水不灭菌，48小时后其COD含量较起始降低了52.72％(见图6中的B图，湖水不灭菌+H7菌株)。两种体系中，均是在湖水灭菌的条件下，其COD含量降低的更多，在这种条件下，菌株H7不用和湖水中的原位菌产生竞争，发挥了更主要的作用。这说明菌株H7对污染区COD的降低有一定的作用。

此外，通过HPLC-HG-ASF和紫外分光光度计的方法测定无论是灭菌还是不灭菌的湖水，其基本上不会氧化As(III)，也不会降解3-羟基苯甲酸和4-羟基苯甲酸。

综上所述，本发明分离的氢噬胞菌H7即使在起始浓度很低的条件下，其依然能在自然水体中将高毒的As(III)氧化成低毒的As(V)且能降解3-羟基苯甲酸和4-羟基苯甲酸，表明，氢噬胞菌H7在低营养、单一存在、与其它微生物共存的情况下均对三价砷有很好的氧化效果，对3-羟基苯甲酸和4-羟基苯甲酸同样具有很好的降解效果，并在一定程度上能降低污染区的COD，此外氢噬胞菌H7还具有反硝化除氮的能力，显示本发明具有较好的应用前景。