一株恶臭假单胞菌代谢芳香化合物产物及机理研究

摘要

多氯联苯（PCBs）、溴代联苯醚（PBDEs）、芴（FN）和多氯代二苯并二恶英（PCDDs）等是环境中的持久性有机污染物。这些化合物一般都具有致癌、致畸、致突变的三致特性，释放到环境中会严重地威胁人类的健康。研究微生物降解该类化合物，对修复被其污染的环境具有很重要的理论意义和应用价值。 本工作以课题组前期筛选得到一株能以联苯为唯一碳源生长的恶臭假单胞菌Pseudomonas putida B6-2为研究对象，研究了该菌株对于模式化合物DE、FN和DD的降解特性，以及代谢途径。P．putida B6-2是一株能以联苯为唯一碳源生长的菌株，该菌株也能以联苯降解上游途径的最终产物苯甲酸为唯一碳源生长，说明该菌株可以将联苯完全矿化，具有降解PCBs的潜力。 研究发现B6-2不能够利用DE，FN和DD生长，进一步考察了利用联苯生长的菌株降解DE的能力，初步研究该菌株降解DE的中间产物，发现该菌株能通过侧面双加氧途径降解DE，生成对二苯酚和苯酚等化合物；研究了菌株B6-2对多环芳烃的代表性化合物FN的降解特点，发现在降解过程中，有两个产物积累分别为9-芴酮和9-芴醇，说明该菌株可以攻击FN中间的五碳环；还检测到微量的产物1-茚酮，说明P．putida B6-2也可以通过侧面双加氧途径降解FN；研究了菌株代谢二恶英类化合物DD的特性，检测到的三个中间产物，邻苯二酚和羟基取代的DD，以及DD代谢的侧面双加氧开环产物，发现该菌株可以通过侧面双加氧途径降解DD。综上所述，该菌株降解以上各类化合物主要通过侧面双加氧途径，生成苯酚和邻苯二酚等物质，而菌株B6-2可以以苯酚和邻苯二酚为底物生长，说明菌株B6-2可以通过共代谢将这些化合物完全或者部分矿化，具有较好的降解能力。 研究了P．putida B6-2联苯降解基因簇的序列组成。通过构建pUC文库和筛选转化子的手段，测序获得了该菌株的联苯降解基因簇，该联苯降解基因簇包含联苯上游降解基因簇和下游降解基因簇。联苯的上游降解途径包含bphABCKHJID八个基因，这八个基因的排列顺序与联苯降解菌Burkholderia sp。LB400和Pseudomonas pseudoalcaligenes KF707相似。其中bphABCD基因将联苯转化为2-Hydroxypenta-2，4-dienoate和苯甲酸，而bphKHJI基因簇是负责降解2-Hydroxypenta-2，4-dienoate的。下游降解基因簇为水杨酸降解基因簇（nah），该基因簇也存在于KF707之中与上游降解基因簇相距6 kb，菌株B6-2中该基因簇与菌株KF707具有100％的相似性。而bphABCKHJID基因簇也仅联苯双加氧酶基因（bphA）的氨基酸序列与KF707稍有不同，可能是这二者降解能力差别的主要原因。 通过将降解PCBs广底物谱菌株Burkholderia sp． LB400的联苯双加氧酶基因bphA导入联苯降解菌株P．μputida B6-2中，构建更广底物谱的PCBs降解菌株。通过原位PCR检测证实菌株LB400的联苯双加氧酶基因bphA已经导入了菌株B6-2之中，但是检测不到该酶的活性，在降解PCBs同系物2，2’，3，3’-四氯联苯时，获得LB400 bphA基因的B6-2菌株与野生型的B6-2菌株没有差异，对该化合物没有降解能力。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章前言

1.环境中多氯联苯、溴代联苯醚、芴和二恶英的分布及特点

1.1环境中多氯联苯的特征及分布

1.2环境中溴代联苯醚的特征及分布

1.3环境中芴的特征及分布

1.4环境中二苯并二恶英的特征及分布

2.多氯联苯、联苯醚及溴代联苯醚和芴的微生物代谢机理

2.1多氯联苯的微生物降解

2.2联苯醚及溴代联苯醚的微生物降解

2.3芴的微生物降解

2.4二苯并二恶英的微生物降解

第二章联苯降解菌Pseudomonas putida B6-2代谢联苯醚、芴、二苯并二恶英

1.材料与方法

1.1材料

1.2方法

2.结果与讨论

2.1 Pseudomonas putida B6-2分别以联苯和苯甲酸为唯一碳源生长

2.2 Pseudomonas putida B6-2降解联苯醚及代谢产物分析

2.3 Pseudomonas putida B6-2降解芴及代谢产物分析

2.4 Pseudomonas putida B6-2降解二苯并二恶英及代谢产物分析

3.小结

第三章 Pseudomonas putida B6-2基因组文库的建立及联苯降解基因簇的筛选

1.材料与方法

1.1材料

1.2方法

2.结果与讨论

2.1大质粒的提取

2.2基因组的提取

2.3随机切断基因组

2.4.基因组文库的检测

2.5基因簇的筛选

2.6联苯降解基因簇的分析

3.小结

第四章广底物谱多氯联苯降解基因工程菌株的构建

1.材料与方法

1.1材料

1.2方法

2.结果与讨论

2.1 Burkholderia sp.LB400联苯双加氧酶的克隆

2.2含有bphA穿梭载体的构建

2.3将构建好的质粒导入P.putida B6-2中

3.小结

结束语

附录

参考文献

致谢