Analysen zum onkogenen Potenzial des E1B-55K-Proteins von Adenovirus Typ 5

摘要

Das 55-kDa Genprodukt der frühen Region 1B (E1B-55K) von Adenovirus Serotyp 5 (Ad5) ist ein multifunktionelles Phosphoprotein, das eine zentrale Rolle im Ad5-vermittelten Transformationsvorgang primärer Zellen einnimmt. Den onkogenen Aktivitäten des E1B-Proteins liegen verschiedene Wirkmechanismen zugrunde. An erster Stelle steht dabei die Inaktivierung des zellulären Tumorsuppressorproteins p53 auf der Ebene der Transkription. Als weitere Faktoren werden schon seit längerem eine intrinsische Kernexportaktivität und posttranslationale Funktionen vermutet, die über unterschiedliche Bereiche im viralen Polypeptid reguliert werden. Soweit bekannt, handelt es sich dabei um ein Leucin-reiches Kernexportsignal (NES) sowie um zwei hoch konservierte Sequenzmotive, die große Übereinstimmung zu sog. BC-Boxen oder atypischen RING-Fingerdomänen aufweisen.Vor dem Hintergrund dieser Beobachtungen wurden in der vorliegenden Arbeit weiterführende Untersuchungen zur Funktion des NES, der BC-Box und der RING-Fingerdomäne im E1B-55K-induzierten Transformationsvorgang durchgeführt. Im Mittelpunkt der Arbeiten standen verschiedene Mutanten des E1B-Proteins, die definierte Aminosäureaustausche in den entsprechenden Sequenzmotiven enthalten. Durch klassische Transformationsexperimente auf der Basis primärer Rattenepithelzellen gelang zunächst der Nachweis, dass die Kernexportfunktion des E1B-Proteins für seine transformierenden und onkogenen Eigenschaften nicht essenziell ist. Vielmehr zeigen die erzielten Ergebnisse, dass die Inhibition des Kernexportvorgangs die Transformationsrate und Tumorigenität der transformierten Zellen deutlich steigert. Die erhöhte Focus-Bildung und Tumorigenität der Zellen korreliert mit einem signifikanten Anstieg der E1B-vermittelten Repression p53-stimulierter Transkription, der vollständigen Umverteilung von p53 und PML-NB-Kerndomänen in große Proteinaggregate und der Bindung von E1B-55K an die PML-NB-Komponenten daxx und PML. Diese Beobachtungen zeigen erstmalig, dass die Wechselwirkung von E1B-55K mit daxx und PML und die damit verbundene Modulation der PML-NB-Kerndomänen einen wichtigen Schritt in E1B-induzierten Transformationsprozess darstellen.Diese Annahme wird durch die Untersuchungen zur Funktion der BC-Box und RING-Fingerdomäne unterstützt. Die Ergebnisse dieser Versuche zeigen, dass bestimmte Aminosäureaustausche in der BC-Box (E1B-BC1) oder in der RING-Fingerdomäne (E1B-RF6) die Transformationsrate deutlich reduzieren. Dabei korreliert der Phänotyp der BC1-Mutante mit dem Verlust der Inhibition p53-stimulierter Transkription in Reportergenanalysen. Im Gegensatz dazu wird die Repression von p53 durch die Mutationen in E1B-RF6 kaum beeinträchtigt. Dieser Befund ist hoch interessant, da er erstmals eine p53-unabhängige Funktion des E1B-Proteins im Ad5-vermittelten Transformationsprozess aufzeigt. Auf molekularer Ebene wird diese Aktivität höchstwahrscheinlich über die Wechselwirkung mit dem zellulären PML-NB-assoziierten Protein Mre11 vermittelt, das bekanntermaßen eine zentrale Rolle in der Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen spielt. Interessanterweise verhindern die Mutationen in E1B-RF6 neben der Bindung an Mre11 auch die Umverteilung von PML-NBs und p53 in subnukleäre Proteinaggregate. Dies lässt vermuten, dass E1B-55K die Funktion und Lokalisation von PML-NBs bzw. PML-NB-assoziierten Komponenten über die Bindung an Mre11 moduliert. Ob und in welchem Umfang E1B-55K dabei die Mre11-regulierten Prozesse der DNA-Reparatur und Telomer-Erhaltung verändert, ist noch unklar. Erste Untersuchungen in diese Richtung weisen jedoch darauf hin, dass möglicherweise eine Funktion von Mre11 verändert wird, die im Zusammenhang mit der Zellzykluskontrolle bei G2/M-Phasenübergang stehen könnte.Im Ganzen zeigen diese Ergebnisse dieser Arbeit erstmals, dass Ad5 E1B-55K über p53-abhängige und -unabhängige Mechanismen zur vollständigen Transformation primärer Zellen beiträgt. Letztere Aktivität wird zumindest teilweise über die Wechselwirkung mit Mre11 und über die Modulation von PML-NBs bzw. den PML-NB-assoziierten Komponenten daxx und PML reguliert. Da alle bislang untersuchten DNA- und RNA-Tumorviren Genprodukte besitzen, die die Integrität von PML-NBs verändern, könnte die Bindung an Mre11 und die Mre11-abhängige Modulation von PML-NBs durch E1B-55K einen allgemein gültigen Mechanismus virusinduzierter Onkogenese darstellen.