Analysen zur Funktion des E1B-55K-Proteins von Adenovirus Typ 5 im lytischen Replikationszyklus

摘要

Das E1B-55K-Protein von Adenovirus Typ 5 ist ein multifunktionelles Phosphoprotein, das eine zentrale Rolle im produktiven Replikationszyklus von Ad5 einnimmt. Die lytischen Aktivitäten des E1B-Proteins werden zumindest teilweise im Komplex mit dem viralen Protein E4orf6 vermittelt. Soweit bekannt fördert der E1B-55K/E4orf6-Komplex (E1B/E4-Komplex) den nukleozytoplasmatischen Transport viraler mRNAs und fördert somit die Synthese viraler Kapsidproteine bzw. die Produktion von Nachkommenviren. Darüber hinaus werden dem E1B/E4-Komplex auch posttranslationale Funktionen beim proteasomalen Abbau des zellulären Tumorsuppressorproteins p53 und dem zellulären DNA-Reparaturkomplex MRN (Mre11, Rad50, NBS1) zugeordnet. Es gibt erste Hinweise, dass beide Aktivitäten mit einer nukleozytoplasmatischen Pendelfunktion in Verbindung stehen, die über ein CRM1-abhängiges Leucin-reiches Kernexportsignal (NES) in beiden viralen Proteinen und ein zum E1B-NES eng benachbartes SUMO1-Konjugationsmotiv (SKM) reguliert wird.Die vorliegende Arbeit befasste sich mit Untersuchungen zur Funktion der E1B-55K- und E4orf6-Proteine in der Regulation des produktiven Replikationszyklus von Ad5, und insbesondere mit Fragestellungen zur Regulation des viralen mRNA-Transports durch den E1B/E4-Komplex. Dazu wurden im ersten Schritt, mit Hilfe eines direkten Klonierungsverfahrens, Mutationen in die kodierenden Bereiche der E1B- und/oder E4orf6-Gene im Ad5-Genom eingeführt, die zu Aminosäureaustauschen in: (1) den NESs von E1B-55K und/oder E4orf6, (2) im SKM von E1B-55K und (3) in den p53- bzw. MRN-Interaktionsdomänen von E1B-55K führen. Anschließend wurde der Einfluss der Mutationen auf die virale Replikation überprüft. Insgesamt bestätigen diese Versuche die Annahme, dass E1B-55K und vermutlich der E1B-55K/E4orf6-Komplex in lytisch infizierten Zellen kontinuierlich über den Exportrezeptor CRM1 aus dem Zellkern transportiert wird. Im Unterschied zu E4orf6 führen Mutationen im E1B-NES zu einer fast vollständigen Restriktion des viralen Proteins im Zellkern, wo das virale Protein an der Peripherie der sog. viralen Replikationszentren akkumuliert. Interessanterweise wird die nukleäre Restriktion und Lokalisation an den viralen Replikationszentren durch die gleichzeitige Mutation des SKM vollständig aufgehoben. Diese Beobachtungen zeigen erstmals, dass E1B-55K posttranslational durch SUMOylierung an die Orte der viralen DNA-Synthese, Transkription und RNA-Prozessierung dirigiert wird und lassen zudem vermuten, dass die Konjugation mit SUMO1 einen CRM1-unabhängigen Exportweg des viralen Proteins reguliert.Trotz der deutlich veränderten Lokalisation des E1B-55K-Proteins haben Mutationen im E4orf6- und/oder E1B-NES sowie im E1B-SKM keinen negativen Einfluss auf die zytoplasmatische Akkumulation viraler Transkripte, Synthese später Strukturproteine, Produktion von Nachkommenviren und den proteasomalen Abbau von MRN. Dieser Befund ist überraschend und widerspricht vollständig der momentan vorherrschenden Modellvorstellung. Obwohl die molekulare Grundlage dieser Ergebnisse noch unklar ist, zeigen die Untersuchungen dieser Arbeit, dass der nukleäre Export von E1B-55K und E4orf6 auch über die CRM1-unabhängigen RNA-Exportrezeptoren HuR und/oder TAP/NXF1 gesteuert wird, da sowohl die HuR-Liganden pp32 und APRIL als auch das TAP/NXF1-Adaptorprotein Aly/REF1 an den E1B/E4-Komplex binden. Während pp32 bekanntermaßen über E4orf6 mit dem E1B/E4-Komplex wechselwirkt, zeigen Koimmunpräzipitationsversuche erstmalig, dass APRIL und Aly/REF1 über E1B-55K mit dem viralen Proteinkomplex interagieren. Eine direkte Beteiligung von Aly/REF1 am RNA-Exportvorgang wird durch Immunfluoreszenzanalysen unterstützt, die zeigen, dass das RNA-bindende hnRN-Protein an die Peripherie der viralen Replikationszentren rekrutiert wird. Außerdem wurden Hinweise erhalten, dass sowohl p53 als auch MRN an diesen Vorgängen direkt oder indirekt beteiligt sind, da der Verlust des proteasomalen Abbaus dieser zellulären Faktoren über den E1B/E4-Komplex mit einer Reduktion später viraler mRNAs und einer stark verringerten Synthese später viraler Proteine sowie Produktion von Nachkommenviren korreliert.Weiterhin wurden im Verlauf dieser Arbeit erstmals zwei neue Isoformen des E1B-55K-Proteins (E1B-48K und E1B-49K) identifiziert. Nach einem vorläufigen Modell werden diese aminoterminal verkürzten E1B-Proteine aufgrund einer sog. internal ribosomal entry site (IRES) und/oder durch den Vorgang des leaky scanning während der Translation der E1B-55K-mRNA gebildet. Die Phänotypisierung einer E1B-55K-negativen Virusmutante, die nur E1B-48K und E1B-49K bildet, zeigt, dass die Expression beider Isoformen für die effiziente virale Replikation ausreichen.