Bedeutung von Gp96 für die mukosale Toleranzentwicklung und bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen

摘要

In der vorliegenden Dissertation wurde die Expression und Funktion des Glykoproteins Gp96 in intestinalen Makrophagen bei Patienten mit und ohne chronisch entzündliche Darmerkrankungen untersucht. Dabei wurde zunächst die Expression in humaner intestinaler Mukosa untersucht und später die Wirkung von Gp96 auf den Entzündungsverlauf im Transfer-Kolitis-Maus-Modell. Weiterhin wurde die Expression der im NF-kappaB Signalweg eingreifenden Proteine TANK und TBK1 in intestinalen Makrophagen betrachtet. Konstrukte für einen Targeting-Vektor einer konditionellen Gp96-knock-out-Maus wurden hergestellt.Die Expression von Gp96 in intestinalen Makrophagen wurde mittels Affymetrix GeneChip® Analysen, RT-PCR, real-time-PCR (TaqMan®) und immunhistochemischer Färbungen in intestinalen Makrophagen, sowohl im humanen, als auch im murinen System untersucht. Gp96 wird in intestinalen Makrophagen exprimiert und bei der Differenzierung zu diesen induziert. Um dies zu prüfen, wurde die Gp96-Expression in Monozyten und in in vitro differenzierten Makrophagen mittels real-time-PCR und RT-PCR analysiert. Im MZS-Modell zur Differenzierung von Monozyten in intestinale Makrophagen wurde gezeigt, dass Gp96 differenzierungsspezifisch für intestinale Makrophagen ist. Gp96-Protein ist in intestinalen Makrophagen bei Morbus Crohn nicht nachzuweisen, bei anderen intestinalen Entzündungen, wie Colitis ulcerosa und Divertikulitis, ist es exprimiert. Daher kann man vermuten, dass Gp96 essenziell für die Aufrechterhaltung der Toleranz gegenüber luminalen Antigenen ist.Gp96 wurde zur Behandlung von immundefizienten Scid-Mäusen, bei denen durch den Transfer von CD4+ CD62L+-Zellen eine Kolitis induziert wurde, eingesetzt. Des Weiteren wurden Balb/c-Donortiere mit Gp96, peptidbeladenem Gp96 oder denaturiertem Gp96 behandelt und die T-Zellen auf Scid-Tiere übertragen. Es konnte festgestellt werden, dass die Behandlung der T-Zell-Spendertiere mit Gp96 einen positiven Effekt auf die Ausprägung der intestinalen Entzündung mit sich bringt. Auch die Behandlung der Tiere nach dem T-Zell-Transfer mit Gp96 führte zu diesem Ergebnis. Vor allem der histologische Score dieser Tiere war signifikant besser als der von Kontrolltieren. Auch die Analyse der Zytokinprofile der Donorzellen und der mesenterialen Lymphknotenzellen aus den Scid-Tieren zeigte, dass durch Gp96 T-Zellen generiert werden, die hauptsächlich TH2-Zytokine produzieren (IL-4, IL-10, IL-13) und somit regulatorische Funktion haben können. Die Transfer-Experimente lassen den Schluss auf eine essenzielle Rolle von Gp96 in der Aufrechterhaltung der Toleranz gegenüber luminalen Antigenen zu. Da Gp96 in intestinalen Makrophagen bei Morbus Crohn und der Transfer-Kolitis fehlt, kann vermutet werden, dass der Verlust von Toleranz für die Pathophysiologie bei Morbus Crohn wichtig ist.Die für den Targeting-Vektor benötigten drei Fragmente aus dem Maus-Genom, die Neomycin-Resistenz und das lox p-Element wurden per PCR amplifiziert und in jeweils einen Topo-Vektor kloniert. Die Sequenzierungen ergaben, dass es sich um die gewünschten Gensequenzen handelt, so dass die Klonierung des Targeting-Vektors fortgesetzt werden kann.Die Expression von TANK und TBK1 in intestinalen Makrophagen wurde zunächst mit Affymetrix GeneChip® Analysen untersucht. Dabei zeigte sich, dass die Expression von TANK in intestinalen Makrophagen, im Vergleich zu in vitro differenzierten Makrophagen, erhöht, die von TBK1 erniedrigt war. Durch Western Blot wurde gezeigt, dass TANK in LPMNZ der intestinalen Mukosa sowohl bei Entzündung als auch ohne Entzündung exprimiert wird. Durch Immunhistochemie konnte gezeigt werden, dass TANK in intestinalen Makrophagen vorkommt, wenn keine Entzündung vorherrscht. Bei Morbus Crohn wurde TANK in anderen noch nicht näher charakterisierten Zellen gefunden. Die Heraufregulation von TANK, bei gleichzeitiger Herabregulation von TBK1, in normalen intestinalen Makrophagen könnte zur Inhibierung einer TRAF2 vermittelten NF-kappaB-Aktivierung führen, was die Differenzierung in einen anergen Makrophagentyp unterstützt. Das Fehlen von TANK in intestinalen Makrophagen bei Morbus Crohn könnte eine erhöhte TRAF2 vermittelte NF-kappaB Aktivität zu Folge haben.