Utilisation des boues des usines de traitement comme moyen alternatif pour la production de l'insecticide microbien Bacillus Thuringiensis.

摘要

L'utilisation des boues d'épuration comme milieu alternatif de culture pour la productionuddu biopesticide B. thuringiensis a été évaluée en tenant compte que celles-ci contiennentuddes éléments pouvant soutenir la croissance, la sporulation et la production de la δ-udendotoxine. Dans ces expériences la souche employée était B. thuringiensis var. kurstakiudHD-l qui est la bactérie la plus utilisée pour lutter contre un grand nombre des larves deudlépidoptères. Au Québec elle est employée pour contrôler la tordeuse des bourgeons deudl'épinette.udLa première étape de ce projet consistait à tester des boues de différents types et origines.udAinsi, les expériences ont été réalisées avec la boue primaire de Valcartier (ValP), la boueudsecondaire de Black Lake (BLS), la boue secondaire digérée aérobiquement de BlackudLake (BLDA), la boue secondaire de Sainte Claire (SCS), la boue secondaire deudBeauceville (BVS), la boue seéondaire d'une usine de pâtes et papiers (PPS) et la boueudsecondaire du réacteur à membranes de cette même usine de pâtes et papiers (PPRMS).udComme les conditions d'utilisation peuvent avoir une influence sur développement de laudbactérie, chaque boue a été utilisée sous trois conditions de préparation, c'est-à-dire, sansudprétraitement, avec prétraitement (hydrolyse à l'acide sulfurique) ou le surnageant seuluddes boues hydrolysées obtenu après une centrifugation. Le temps nécessaire pourudatteindre la sporulation maximale de B. thuringiensis dans les boues a varié selon laudpréparation des boues, ce qui a eu une influence sur la disponibilité des nutriments. Dansudles boues sans prétraitement la durée était de dix à onze jours. En utilisant les bouesudprétraitées, le temps a été réduit de huit à neuf jours, et avec les surnageants la durée étaitudde quatre à six jours. Le pH initial de la boue joue un rôle important sur le développementudde la bactérie; dans ces expériences en utilisant la boue primaire de Valcartier (ValP) sansudprétraitement (pH=5.5), la bactérie n'a pas été capable de se développer, donc il a étéudconstaté qu'un pH initial près de la neutralité peut améliorer la performance des boues. Leudpotentiel entomotoxique des complexes spores-cristaux obtenus dans les fermentationsudréalisées avec les différentes boues, a été estimé par des bioessais en utilisant des larvesudde la tordeuse des bourgeons de l'épinette comme insecte cible. L'hydrolyse de boues audeu un impact positif sur le potentiel entomotoxique, une activité plus élevé a été obtenueud(4100 UI/µL) avec la boue secondaire de Black Lake (BLS) qu'avec le milieu deudréférence (farine de soja, 3800 UI/µL), tandis que l'utilisation des surnageants ne s'avèreudpas recommandable parce que les potentiels entomotoxiques des complexes spores"'udcristaux ont présenté des valeurs inférieures à celles rencontrés en utilisant les boues nonudhydrolysées et les boues hydrolysées.udL'influence du pH et de la température sur la croissance, la sporulation et la production deudla δ-endotoxine par B. thuringiensis var. kurstaki HD-l ont été étudiées en utilisant laudboue secondaire de Jonquière (JS). L'effet de ces deux paramètres a été évalué dans uneudpremière expérience en réalisant des fermentations entre 30 °C et 36 °C et en mêmeudtemps en utilisant cette boue hydrolysée à différents pH. La deuxième expérienceudconsistait à maintenir constant le pH pendant toute la fermentation à l'aide des tamponudTRIS et PBS. Une troisième expérience consistait à appliquer un choc thermique aprèsudavoir atteint la phase de croissance exponentielle de façon à promouvoir la sporulation deudla bactérie. En général, c'est entre 30 °C et 32 °C que les potentiels entomotoxiques et lesudconcentrations des complexes spores-cristaux plus élevés sont obtenus. Pour le pH, auudmoins pour la boue secondaire de Jonquière, l'hydrolyse ne semble pas avoir uneudinfluence sur le potentiel entomotoxique des complexes spores-cristaux obtenus. Donc enudutilisant cette boue comme milieu de culture il ne serait pas nécessaire d'effectuerudl'hydrolyse, ce qui réduit le coûts de production du biopesticide. La croissance, laudsporulation et la production de la δ-endotoxine ont été affectées en utilisant lesudtempératures de 34 °C et 36 °C comme le démontrent les faibles taux maximauxudspécifiques de croissance, les pourcentages de sporulation et les potentielsudentomotoxiques des produits obtenus à ces températures. Il est donc fortementudrecommandable de ne pas réaliser les fermentations à ces températures et de travaillerudplutôt entre 30 °C et 32 °C. Le contrôle du pH réalisé à l'aide des tampons pendant lesudfermentations, a eu un impact bénéfique sur la croissance, la sporulation et la productionudde la δ-endotoxine. Les pourcentages de sporulation et les potentiels entomotoxiques desudéchantillons de la boue de Jonquière contenant les tampons ont augmenté par rapport àudceux de l'échantillon sans contrôle du pH. Il serait souhaitable de réaliser des études plusudapprofondies pour évaluer l'influence d'un choc thermique plus sévère que celui réaliséuddans ces expériences où nous n'avons pas trouvé des améliorations au niveau desudpourcentages de sporulation ou du potentiel entomotoxique.udL'influence de l'agitation sur la croissance, la sporulation et la production de la δ-endotoxineudpar B. thuringiensis a été étudiée en réalisant des expériences à quatre niveauxudd'agitation, soit à 50 rpm, 150 rpm, 250 rpm et 350 rpm. Il a été constaté que quand lesudconditions d'aération ne sont pas adéquates (50 rpm), la croissance de la bactérie peutuddevenir lente et la sporulation inhibée, ce qui affecte le potentiel entomotoxique duudcomplexe spores-cristaux. C'est à 250 rpm que le potentiel entomotoxique plus élevé audété obtenu et en même temps les résultats ont démontré que le niveau d'agitation ne peutudpas être augmenté indéfiniment, car le potentiel entomotoxique des complexes spores-cristaux obtenus à 350 rpm présente une valeur inférieure à celles obtenus à 250 rpm; ceudrésultat peut s'expliquer par une inhibition par excès du substrat, dans ce cas deudl'oxygène. La culture de la bactérie dans un bioréacteur où les conditions d'aérationudpeuvent être contrôlées pourrait aider à clarifier ce point.udLa boue secondaire de Black Lake (BLS) a été employée afin d'évaluer l'influence queudl'addition des sources de nutriments peut avoir sur la croissance, la sporulation et laudproduction de la δ-endotoxine par B. thuringiensis. Le glucose a été choisi comme sourceudadditionnelle de carbone et l'extrait de levure comme source d'azote et de vitamines.udInitialement la boue a été enrichie de glucose, dont les concentrations variaient entre 40udmg/L et 200 mg/L. Il a été observé une réduction du temps nécessaire pour atteindre laudsporulation maximale dans les échantillons additionnés de glucose (5 jours) par rapport àudl'échantillon qui n'en contenait pas (10 jours) et aussi une augmentation du pourcentageudde sporulation dans les échantillons contenant le glucose. Les potentiels entomotoxiquesudse sont aussi améliorés à mesure que la concentration du glucose a augmenté. Ils ontudvarié de 3300 UI/µL pour la concentration plus faible de glucose employée (40 mg/L)udjusqu'à 5300 UI/µL pour la concentration de glucose la plus élevée ajoutée à la boue (200udmg/L). L'addition de l'extrait de levure (40 mg/L) en plus du glucose, a augmenté lesudpotentiels entomotoxiques des complexes spores-cristaux obtenus, entre 3500 UI/µL etud6600 UI/µL. Le temps pour atteindre la sporulation maximale est resté le même que dansudles expériences réalisées seulement avec l'addition du glucose (5 jours). Ces expériencesudont montré qu'en variant la composition de la boue par l'addition de certains substrats, saudperformance pour soutenir la croissance, la sporulation et la production de la δ-udendotoxine par B. thuringiensis peut être améliorée.udLa stabilité des caractéristiques génétiques au niveau des gènes qui codent pour l'activitéudinsecticide des cristaux produits par B. thuringiensis var. kurstaki HD-l, quand la bactérieuda été cultivée dans des boues d'épuration, a été vérifiée par l'utilisation de laudpolymérisation en chaîne (PCR) en utilisant des amorces spécifiques pour chacun desudgènes. Dans tous les échantillons analysés, les gènes CryIA(a), CryIA(b) et CryIA(c) quiudcodent pour l'entomotoxicité des cristaux produits pendant la sporulation chez cetteudvariété, ont été identifiés. Ce fait indique que B. thuringiensis peut être cultivé dans lesudboues d'épuration sans affecter ses caractéristiques génétiques au niveau de ces troisudgènes.udL'utilisation des boues d'épuration comme milieu de culture pour la production duudbiopesticide B. thuringiensis semble une alternative intéressante du point de vue de leurudrecyclage. D'un autre coté, l'utilisation des boues d'épuration pour la production de ceudbioinsecticide peut aider à réduire ses coûts de production, ce qui aidera à augmenter sonudutilisation pour contrôler certains insectes nuisibles. Des expériences en utilisant d'autresudsouches de B. thuringiensis pourraient augmenter le spectre d'utilisation des bouesudcomme milieu de culture.udLes résultats obtenus au cours de ces recherches ont fait l'objet d'une demande de brevetudinternational ainsi qu'aux États Unis. Le brevet international étant déjà accepté.ud