Postep w rozwoju techniki cyklicznej polimeryzacji DNA in vitro - Real-Time PCR

摘要

Reakcja polimeryzacji lańcuchowej (PCR) (14) od wielu lat uznawana jest za nowy standard wykrywania genów drobnoustrojów, roslin i zwierzat. W metodzie tej wykorzystuje sie pary oligonukleotydów (star-tery), z których kazdy hybrydyzuje do jednejz nici podwójnego lańcucha DNA, i które ograniczaja fragment ulegajacy powieleniu w wyniku cyklicznej reakcji polimeryzacji (amplifikacji) DNA. Oligonukleoty-dy sa substratem dla polimerazy DNA, która na zasadzie komplementarnosci dobudowuje do nichkolejne nukleotydy, tworzac kopie nici DNA, z która zwiazal sie starter. Calosc procesu PCR opiera sie na wielokrotnym (25-45 cykli) powtarzaniu trzech etapów: de-naturacji (95°C), hybrydyzacji (annealing) (50-65°C) i wydluzania startera (72°C). W trakcie kolejnych cykli amplifikacji mozna wyróznic faze logarytmiczna, w trakcie której w warunkach idealnych dochodzi do podwajania sie liczby kopii DNA w kazdym cyklu, faze przejsciowa, w czasie której obserwuje sie hamujacy wplyw niedoboru polimerazy, starterów oraz nagromadzonych produktów PCR, przez co amplifikacja stopniowo staje sie coraz mniej efektywna, oraz faze plateau, w której nie dochodzi juz do powielania DNA.