Мутантная оксидаза d-аминокислот с улучшенной каталитической эффективностью к d-аминокислотам с объемными боковыми заместителями

摘要

Оксвдаза d-аминокислот из дрожжей Trigonopsis variabilis (TvDAAO) широко используется в тонком органическом синтезе, в частности для получения неприродных l-аминокис-лот и α-кетокислот. Для получения фермента, специфичного к d-аминокислотам с объемной боковой группой, был проведен анализ трехмерной структуры TvDAAO, который выявил, что на входе в активный центр находится остаток Phe54, контролирующий вход субстратов. Остаток Phe54 был заменен на остатки Ala, Ser и Туг. При культивировании рекомбинантных штаммов Е. соИ — продуцентов мутантных TvDAAO — найдено, что мутеин с заменой Phe54Ala обладает очень низкой стабильностью — инактивация фермента проходит в течение 10 мин после разрушения клеток. Мутантные TvDAAO Phe54Ser и TvDAAO Phe54Tyr очищены до гомогенного состояния, изучены их термостабильность и каталитические свойства. По сравнению с исходной TvDAAO в результате введения замен Phe54Ser и Phe54Tyr происходит стабилизация белковой глобулы — период полуинактивации мутантных ферментов при 54 °С увеличился в 1.5 и 2 раза соответственно. Как и в случае TvDAAO дикого типа, термоинактивация мутеинов протекает в две стадии по диссоциативному механизму. Введение мутаций привело к резкому изменению профиля субстратной специфичности, причем с рядом d-аминокислот мутантные ферменты не проявили никакой активности (TvDAAO Phe54Ser — с d-Ala, d-Ser, d-Val и d-Thr, TvDAAO Phe54Tyr — с d-Ser, d-Tyr, d-Thr и d-Lys). В случае мутантной TvDAAO Phe54Ser каталитическая эффективность (отношение k_(cat)/K_M)d к d-аминокислотам с объемными боковыми заместителями (d-Lys, d-Asn, d-Phe, d-Tyr, d-Тф и d-Leu) увеличилась от 2.4 до 7.3 раз.