d-氨基酸氧化酶定向固定在血红素修饰的碳纳米管上模拟多酶催化体系

摘要

D-氨基酸氧化酶(DAAO)催化D-型氨基酸生成其对应的α-酮酸，并伴有副产物过氧化氢产生(H2O2)。在该实验中，D-氨基酸氧化酶被修饰连接上一段类弹性蛋白(ELP)，并将该已修饰的酶蛋白固定到多壁碳纳米管上(MWCNTs)。多壁碳纳米管首先被羟高铁血红素(hematin)所修饰，再将ELP修饰的DAAO(ELP-DAAO)固定到已在碳纳米管上的hematin上，这种定向的固定方式使的ELP-DAAO分子和hematin分子在空间上以分子水平上的距离相靠近。这种分子距离上的靠近使的ELP-DAAO催化产生的H2O2能迅速地被hematin所分解。同时，生成的氧气(O2)又充分地被用来氧化DAAO的辅酶——还原态的黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)，并产生H2O2。从而在ELP-DAAO和hematin之间形成一个从H2O2→O2→H2O2的循环。实验结果表明，该循环作为催化体系的推动力加速主反应的进行。从酶的动力学研究结果可以看出，ELP-DAAO/hematin-CNT催化体系所展现的催化效率是游离ELP-DAAO的三倍多。由此，我们的研究成功构建了一个高效的模拟多酶催化的体系。
　　另外，实验过程中对于该催化体系的构建，运用到了高分辨透射电镜(TEM)、红外光谱(FT-IR)、紫外可见光光谱(UV-vis)、X-射线电子能谱(XPS)等手段对其进行了全程表征，实验结果充分的表明了该催化体系被成功地构建了。
　　最后，对于该种高效的酶固定催化体系的进一步研究。一方面关于固定载体，我们可以用其它的纳米或微米材料来替代MWCNTs。另一方面对于在本实验中用到的DAAO也可以被其它的氧化酶来替换，从而形成更多更广泛的模拟多酶催化体系。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 D-氨基酸氧化酶

1．1．1 D-氨基酸氧化酶的概述

1．1．2 D-氨基酸氧化酶的催化应用

1．2 羟高铁血红素

1．2．1 羟高铁血红素的概述

1．2．2 羟高铁血红的催化机理

1．2．3 羟高铁血红素的研究发展

1．3 碳纳米管

1．3．1 碳纳米管的概述

1．3．2 碳纳米管在酶固定化上应用

1．4 类弹性蛋白

1．4．1 类弹性蛋白的概述

1．4．2 类弹性蛋白用于蛋白纯化的研究进展

1．5 本文主要研究内容和意义

第二章 D-氨基酸氧化酶的定向固定

2．1 引言

2．2 实验试剂与仪器

2．2．1 主要实验试剂

2．2．2 溶液配制

2．2．3 主要实验仪器

2．3 融合有类弹性蛋白标签的D-氨基酸氧化酶的制取

2．3．1 类弹性蛋白的基因构建和克隆

2．3．2 融合有类弹性蛋白标签的D-氨基酸氧化酶的构建与表达

2．3．3 DAAO的表达与纯化

2．4 羟高铁血红素功能化多壁碳纳米管的构建

2．4．1 多壁碳纳米管的纯化

2．4．2 多壁碳纳米管的巯基化

2．4．3 羟高铁血红素固定到多壁碳纳米管上

2．4．4 羟高铁血红素固定到多壁碳纳米管上的定性分析

2．5 ELP-DAAO的定向固定

2．6 本章小结

第三章 ELP-DAAO定向固定的构建过程表征

3．1 引言

3．2 表征仪器

3．3 TEM表征

3．4 FT-IR表征

3．5 XPS表征

3．6 SIM表征

3．7 本章总结

第四章 定向固定D-氨基酸氧化酶的酶活研究

4．1 引言

4．2 实验试剂与仪器

4．2．1 主要实验试剂

4．2．2 溶液配制

4．2．3 主要实验仪器

4．3 功能化碳纳米管催化过氧化氢的探究

4．4 D-氨基酸氧化酶酶活测定

4．4．1 DAAO比活的定义

4．4．2 丙酮酸的标准曲线

4．4．3 固定和游离DAAO的比活

4．5 固定酶和游离动力学的探究

4．6 温度对固定酶和游离酶酶活的影响

4．7 pH对固定酶和游离酶酶活的影响

4．8 固定酶使用重复率的探究

4．9 本章总结

第五章 总结与展望

5．1 总结

5．2 展望

参考文献

致谢

研究成果及发表的学术论文

作者及导师简介