相同組換え法による遺伝子破壊マウス作製技術

摘要

今日，遺伝子改変マウスは個体における遺伝子の機能を解析する上で必要不可欠な材料となっている．ES細胞を用いた相同組換え法による遺伝子破壊マウス作製法は既に確立されており，如何により効率よく確実にそれをおこなうかが求められる．LIFの発見などで培養条件が確立されつつあるとはいえ，ES細胞を生殖細胞系列への分化能を喪失しないように培養するには未だ注意を要する．またES細胞からのキメラマウス作製には高度な技術的習得が必要である．しかし最も問題となるのは遺伝子を破壊する方法であり，組換え頻度や表現型はベクターの構造に左右されると言っても過言ではない．本稿ではこれから遺伝子破壊マウスを作製する研究者に向けて，相同組換え頻度の高いターゲティングベクター構築法と，確実な相同組換え体の単離同定法について主に述べる．どちらも原理は単純である．ターゲティングベクターでは相同領域を長く設定する事で最大の効果が得られ，時間はかかるが構築は難くない．また相同組換え体の単離同定法では適切なプローブで明確なサザンができれば良い．しかし多くのトラブルや挫折は主にPCRやサザンスクリーニングで生じているのが現状である．これらを回避するためにPCRスクリーニングにおいては，PCR検定用ベクターにて事前に条件検討をおこなう．またサザンスクリーニングでは余剰なバンドを生じない適切なプローブを準備しておく他に，ターゲティングベクター外に設定したプローブを用いることで相同組換え体候補を選別し，その後にコピー数の検討など確定作業をおこなう．最終的には複数の相同組換え体クローンからキメラマウスを作製し，見出された表現型が標的遺伝子を破壊した結果であることを確認する．