前培養とPCR法を組み合わせたマイコプラズマ生菌の検出　　～PCR法を導入したマイコプラズマ否定試験法の検討～

摘要

生物学的製剤の品質及び安全性確保のために、多くの微生物学的汚染に関する試験が行われている。中でもマイコプラズマ否定試験は、動物用生物学的製剤基準に定められている他、国際標準法（ⅤICH法）の策定が進むなど、生ワクチンの試験として極めて重要な位置づけにある。現行法では、液体選択培地で増菌させた後に、平板培地によるコロニーの形態的同定を組み合わせた方法が採用されている。我々は、現行法の同定ステップをPCR法に置き換えた新しい生菌検出法を考案し、特異性、感度、試験日数及び労力等多方面から現行法との比較を行った。まず、特異性を確認するため、国内標準及びⅤICH参照株から得たDNA抽出物について、広範囲のマイコプラズマ菌種に共通の配列である16S－23SrRNAを標的としてPCR反応を行い、増幅産物の解析を行った。その結果、電気泳動による増幅断片のサイズ及び融解曲線分析による融解温度は、特定の値を示し、マイコプラズマ属菌同定の明確な指標となることが確認された。次に、前培養時におけるDNA量の経時的変化を定量的に調べたところ、DNA量は対数増殖期のピークまで菌数と比例して増加し、そのまま培養終了時まで減少することなく濃度が維持された。このことから、接種時と増菌後のDNA量を二点で比較することにより、生菌の増殖を簡便確実に検知できることが判明した。感度に関しても、前培養とPCR法の組み合わせによる本試験法の検出限界は10CFU血止以下であり、現行法に比べて遜色なかった。現行法で要求される前培養菌液からの頻繁な継代培養や、平板培地の作製、維持作業が不要となることに加え、二次培養の削減により総試験期間が半減するなど、本試験法は多くの利点を有すると考えられた○以上から、本試験法は現行法と同等以上の正確さを備え、公定法として採用されうる性能を有するものであるとの結論を得た。