乳腺上皮細胞における膜繋留タンパク質pl15遺伝子発現の調節

摘要

膜繋留タンパク賃p115は小胞輸送において、輸送小胞を標的厳に繋留することによって輸送小胞の拡散を防ぎ、小胞輸送の効率を高めると考えられているタンパク質である。 本研究は、泌乳サイク）レ／の過程における乳腺の発達や機能分化に伴うp115mRNA発現量の動態を明らかにし、さらに乳腺上皮細胞の増殖に関するp115遺伝子転写調節のメカニズムを明らかにすることを目的に行った。 　 ホルモン誘起泌乳の過程におけるウシ乳腺の発達、機能分化をモデルに、乳腺組織中mRNA含量の変動をノーザン／．プロット．ハイプリグイゼーション／法で調べたところ、totalRNA量および組織DNA量のどちらで補正した場合においても、発達期の乳腺で最も高値であった。 乳腺組織におけるp115の局在を免疫組織化学的に調べたところ、p115はどの発達．分化の段階においても主に乳腺上皮細胞に分布していたことから、乳腺におけるp115発現の調節は乳腺上皮細胞において行われるものと推察された。 　 膜繋留タンパク質p115の乳腺における発現調節機構について知見を得るため、ウシp115遺伝子の5’上流領域を含むクローンをウシ．ゲノムDNAライブラリーより単離した。 ウシ．ゲノムDNAに対するサザン／ハイプリダイゼーション／解析により、p115遺伝子は単一コピこの遺伝子であると推定された。9つの転写開始点をキャップサイトバンティング法によって同定した。 ルシフェラーゼ．レポ一夕一遺伝子に連結した2．，6kbのウシp115遺伝子の5’上流領域の断片は、ウシ乳腺初代培養細胞（BME）およびヒト乳腺上皮ガン細胞株MCF一7中で機能的なプロモーター活性を示した°5，上流領域の5，側および3，側欠失断片のプロモーター活性をルシフェラーゼ．レポ一夕．一遺伝子アツセイによって調べ、プロモーター機能に要求される部位を限定した。 プロモーター機能が維持されている領域には1つのnuc上ear respiratory factor一1（NRFー1）共通配列が含まれており、NRFー1共通配列を無為にするような変異を導入すると、BMEおよびMCF一7細胞におけるpl15のプロモーター活性が著しく低下した。 Electrophoretic mobilityshift assay（EMSA）によってp115遺伝子プロモーター領域に存在するNRF，1共通配列はMCFー7由来の核タンパク質と特異的に複合体を形成することが示された。 スーパーシフトアッセイによって、p115遺伝子プロモーター領域にあるNRF一1共通配列に結合する核タンパク質はNRFー1であることが示された。 また、eStradio上一17β（E2）あるいはインスリン／およびそれら両者の組み合わせによる刺激は、p115遺伝子プロモーターの転写活性を細胞増殖刺激の強さに従い上昇させた。 以上の結果から、p115遺伝子プロモ，一夕一領域に存在するNRIり1共通配列へのNRFー1の結合は、乳腺上皮細胞におけるp115遺伝子の転写活性化に重要であり、p115遺伝子の転写は、E_2およびインスリンによって刺激される乳腺上皮細胞の増殖に関連して活性化されることが示された。 　 発達期の乳腺におムっては、E2によって誘発された乳腺上皮細胞の増殖に関連してp115遺伝子転写が活性化され、これには転写調節因子NRF一1が関与すると推察される。 乳腺の発達を含めた泌乳過程においては、活発な小胞輸送が行われており、これにp115が深く関わっていると思われる。