DNAバーコーディングを目的としたュスリカDNA抽出方法の比較

摘要

The insect group Chironomidae is used as an environmental indicator for freshwater ecosystems because of its wide distribution and species richness. The morphological identification of chironomids requires expert skill; to this end, the application of DNA barcoding for species identification is a powerful tool. We applied DNA barcoding to chironomid specimens using different preservative conditions and several protocols for extraction and sequencing of DNA and found that the success of sequencing was affected by the condition of specimens and protocols applied. Purification using a silica-membrane filter yielded significantly high DNA quality and was deemed suitable for both old and valuable specimens. On the other hand, rough extraction without any purification and extraction without membrane filters both achieved sufficient DNA quality and sequencing success rates to be applied to well-preserved and large specimens. For old or air-dried samples, however, rough extraction requires great care because it significantly reduces the efficiency of sequencing. DNA extracted from old or poorly preserved specimens tended to be fragmented and was not successfully sequenced, but using alternative PCR primers targeting a shorter region can improve the success rate. Dried wing specimens on prepared slides and pupal exuviae collected from the water surface were also subjected to DNA extraction and subsequent sequencing, which achieved 18.0% and 41.7% success rates, respectively. Such success rates may be insufficient for some purposes of DNA barcoding, but match particular objectives, for example, a field study with less work by collecting exuviae.%ユスリカは広範な分布域とその種多様性から，陸水生態系における主要な環境指標種として用いられ る。しかし，形態による分類·同定が難しく，塩基配列情報に基づく DNAバーコーディングの併用が有用であると考えられる。我々は様々な保存状態のュスリカ標本について，複数の方法でDNAバーコー ディングを進め，塩基配列の取得率が標本の保存状態やDNA抽出方法によってどのように影響された かについて比較を行った。シリカメンブレンフィルターを用いた精製は，保存状態に拠らず取得率が高く，特に貴重な標本や保存状態の悪い標本に適していると考えられた。一方，粗抽出や安価なキットによる抽出も，保存状態が良い標本や大量の標本を扱う際には有用であることが示された。ただし，室温で乾燥した標本や古い標本などに対しては，粗抽出法は有意に塩基配列の取得率が低くなったことから 注意が必要である。古い標本などDNAの断片化により塩基配列が取得できないことが想定される場合は， シークェンス領域を短くすることで，取得率が回復できる場合もあった。また，翅の乾燥プレパラート 標本や，水面から採集される羽化殻についてもDNA抽出とシークェンスを行った。成功率はそれぞれ 18.0%と41.7%と決して高くはなかったが，目的に合致すれば，乾燥した翅標本や羽化殻も，DNAバー コーディングにおいて有用な試料となり得ると考えられた。