Phosphodiesterase-Inhibition durch Kaffee - eine aktivitätsgeleitete Fraktionierung

摘要

Kaffee hat in den vergangenen Jahren zunehmend Bedeutung als „functional food" erlangt. Dieser Umstand geht zurück auf die zahlreichen positiven Effekte für die Gesundheit, wenn Kaffee auf regelmäßiger Basis konsumiert wird. Bei der Untersuchung möglicher Wirkmechanismen konnte festgestellt werden, dass Kaffee sowohl in vitro als auch in vivo ein starker Inhibitor der zyklischen Adenosinmonophosphat (cAMP) Phosphodieste-rasen ist. Phosphodiesterasen (PDE) katalysieren intrazellulär die Hydrolyse der sog. „second messenger" cAMP und cGMP (zyklisches Guanosinmonophosphat) zu den entsprechenden Nukleosidmonophosphaten AMP und GMP. cAMP und cGMP sind wichtige Botenstoffe vieler Signaltransduktionen, die durch sog. „first messenger" (z.B. Hormone, Neurotransmitter) aktiviert werden. Wird der Abbau von cAMP und cGMP durch die Phosphodiesterase gehemmt, kommt es zu deren Anreicherung in der Zelle und zu einer Veränderung der Signaltransduktion. Ein bereits früh entdeckter Hemmstoff der PDEs ist Koffein, das aufgrund seiner Konzentration in Kaffee nicht alleine verantwortlich für die starke Wirkung des Kaffees auf die PDE sein kann. Alkylpyrazine wurden ebenfalls kürzlich als PDE-Inhibitoren identifiziert. Derzeitige Untersuchungen deuten darauf hin, dass weitere Komponenten des Kaffees zu der PDE inhibierenden Wirkung des Kaffees beitragen könnten. Als neue Strategie zur Identifizierung von PDE-Hemmstoffen wurde eine aktivitätsgeleitete Fraktionierung gewählt. Die PDE Inhibition wird dabei mithilfe eines Radioaktivitätsassays in LXFL-529L-Zelllysat bestimmt. Zuerst wurde ein handelsüblicher Kaffee aufgebrüht, gefriergetrocknet, rekonstituiert und zentrifugiert (100000 g). Die erhaltene lösliche (niedermolekulare) und nicht lösliche Fraktion (hochmolekulare, 4,3 % des Lyophilisats) wurden im PDE-Assay eingesetzt. Während der Kaffee bei einer Konzentration von 5 mg/ml eine maximale PDE-Inhibition von 95 % (IC50 = 0,35 ± 0,05 mg/ml) erreichte, zeigten die hochmolekulare Fraktion bei der entsprechenden Konzentration 32 % Hemmung (IC50 = 0,48 ± 0,03 mg/ml), die niedermolekulare 63 % (IC50 = 0,94 ± 0,21 mg/ml). Die niedermolekulare Fraktion, die die stärkste PDE-Inhibition aufwies, wurde in den folgenden Schritten mithilfe einer präparativen HPLC an einer RP18-Säule in zehn Fraktionen aufgetrennt und anschließend im Assay getestet. Die Fraktionen F0, F1, F2, F3 und F4a zeigten keine PDE-Inhibition, die Fraktion F5 zeigte eine schwache Inhibition von 10%, die Fraktionen F4b (40%), F6 (25%), F7 (51 %), F8 (52%) zeigten dagegen hoch signifikante (p ＜ 0,01) Inhibition der Phosphodiesterase. Die zukünftige Forschung beschäftigt sich mit der Identifizierung der einzelnen Substanzen der relevanten Fraktionen und der anschließenden Testung im PDE-Assay.