PCR Multiplex fluorescente para detec??o de bactérias em sêmen bovino

摘要

Este estudo teve como objetivo avaliar o limiar de detec??o da técnica de PCR multiplex fluorescente aliada a eletroforese capilar na detec??o de agentes infecciosos em amostras de sêmen experimentalmente contaminadas com concentra??es decrescentes das bactérias Brucella abortus, Leptospira interrogans sorovar pomona, Campylobacter fetus e Haemophilus somnus. Amostras de sêmen bovino foram experimentalmente contaminadas com concentra??es decrescentes de bactérias obtidas através de dilui??es seriadas na base 10 de modo a obter-se amostras contendo desde 1 vez até 10-7 bactérias/mL a partir da concentra??o inicial de Leptospira pomona, Brucella abortus, Campylobacter fetus e Haemophilus somnus. As dilui??es foram efetuadas individualmente para cada bactéria, bem como nas diferentes concentra??es necessárias para a padroniza??o do teste de multiplex PCR. As extra??es de DNA de todas as solu??es contendo espermatozóides e bactérias analisadas no presente estudo foram realizadas segundo protocolo descrito por Heinemann et al. (2000). Os produtos de PCR multiplex foram avaliados por eletroforese em gel de poliacrilamida 8% e separa??o eletroforética por sistema capilar em equipamento automático de análise de fragmentos de DNA MegaBace. Observou-se a amplifica??o de fragmentos de 193pb, 330pb, 400pb e 415pb a partir do DNA de B. abortus, L. pomona, H. somnus, C. fetus, respectivamente. Na análise por eletroforese capilar de produtos da PCR multiplex do DNA para detec??o simultanea dos quatro patógenos observou-se a sinal de positividade até a dilui??o de 10-3 bactérias/mL vezes da concentra??o inicial da solu??o estoque de cada bactéria. A técnica de PCR multiplex aliada à eletroforese capilar foi usada pela primeira vez para o diagnóstico direto de quatro bactérias patogênicas no sêmen, demonstrando ser um método rápido na detec??o de bactérias causadoras de doen?as reprodutivas.