Does BLM helicase unwind nucleosomal DNA?

摘要

RecQ helicases maintain chromosome stability by resolving several highly specific DNA structures. BLM, the protein mutated in Bloom's syndrome, is a member of the RecQ helicase family, and possesses both DNA-unwinding and strand-annealing activity. In this study, we have investigated the unwinding activity of BLM on nucleosomal DNA, the natural nuclear substrate for the enzyme. We generated a DNA template including a strong nucleosome-positioning sequence flanked by forked DNA, which is reportedly one of the preferred DNA substrates for BLM. BLM did not possess detectable unwinding activity toward the forked DNA substrate. However, the truncated BLM, lacking annealing activity, unwound it partially. In the presence of the single-stranded DNA-binding protein RPA, the unwinding activity of both the full-length and the truncated BLMs was promoted. Next, the histone octamer was reconstituted onto the forked DNA to generate a forked mononucleosome. Full-length BLM did not unwind the nucleosomal DNA, but truncated BLM unwound it partially. The unwinding activity for the mononucleosome was not promoted dramatically with RPA. These results indicate that full-length BLM may require additional factors to unwind nucleosomal DNA in vivo, and that RPA is, on its own, unable to perform this auxiliary function.Les hélicases RecQ maintiennent la stabilité des chromosomes en résolvant des structures d'ADN hautement spécifiques. BLM, la protéine mutée dans le syndrome de Bloom, est un membre de la famille des hélicases RecQ qui à la fois déroule l'ADN et hybride les brins. Dans cette étude, nous avons examiné le déroulement de l'ADN nucléosomique par BLM, le substrat nucléaire naturel de l'enzyme. Nous avons généré une matrice d'ADN comprenant une séquence forte de positionnement du nucléosome, flanquée d'une fourche d'ADN, un des substrats préférés de BLM selon ce qui est rapporté. BLM ne possédait pas d'activité de déroulement détectable envers les fourches d'ADN. Cependant, la protéine BLM tronquée, dépourvue d'activité d'hybridation, les défaisaient partiellement. En présence de la protéine RPA qui lie l'ADN simple brin, l'activité de déroulement de BLM de pleine longueur et de BLM tronquée était favorisée. L'octamère d'histones a ensuite été reconstitué sur la fourche d'ADN pour générer un mononucléosome « en fourche ». La BLM ne déroulait pas l'ADN nucléosomal mais la BLM tronquée le déroulait partiellement. Le déroulement du mononucléosome n'était pas favorisé sensiblement par la RPA. Ces résultats indiquent que la BLM de pleine longueur pourrait nécessiter des facteurs additionnels pour dérouler l'ADN nucléosomal in vivo, et que la RPA est incapable de remplir cette fonction auxiliaire par elle-même.