尿液细胞来源iPSCs-NSCs联合3D打印支架移植修复大鼠急性脊髓损伤的研究

摘要

目的 探讨尿液细胞(UC)来源重编程诱导性多能干细胞(iPSCs)分化的神经干细胞(NSCs)联合3D打印支架移植修复大鼠急性脊髓损伤(ASCI)的作用.方法 将UC诱导分化为iPSCs,通过ALP活性检测、HE染色观察畸胎瘤形成及免疫荧光检测全能性蛋白OCT4、NANOG、TRA-1-81、TRA-1-60的表达验证iPSCs全能性.将iPSCs向NSCs分化,免疫荧光染色检测巢蛋白(Nestin)、神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和β-微管蛋白(β-tubulinⅢ)的表达.制备3D打印支架.选择成年雄性SD大鼠42只,按随机数字表法分为模型组、支架模型组、iPSCs-NSCs组,每组14只.采用改良Allens法建立大鼠ASCI模型,1周后模型组于损伤处滴入DMEM培养液0.2 ml,支架模型组于损伤处植入载DMEM培养液的2～3 mm支架,iPSCs-NSCs组于损伤处植入载iPSCs-NSCs的2～3 mm支架.1、2、4、6、8周后采用开放领域运动测试(BBB)评分评价3组大鼠关节协调功能.8周后采用Tarlov和Rivlin评分评价3组大鼠后肢运动功能,生物信号采集处理系统观察大鼠运动、感觉诱发电位潜伏期和振幅;取伤段脊髓组织做病理检查,观察脊髓组织病理改变.结果 成功提取UC并诱导分化为iPSCs,ALP染色呈阳性,HE染色显示畸胎瘤形成;免疫荧光染色显示全能性蛋白OCT4、NANOG、TRA-1-81、TRA-1-60表达.成功诱导iPSCs分化为NSCs,GFAP和β-tubulinⅢ表达良好表明细胞分化能力良好.成功打印3D支架,电镜显示内部呈三维立体疏松多孔结构.干预2、4、6、8周后,iPSCs-NSCs组大鼠BBB评分均高于模型组和支架模型组(均P<0.05);干预8周后,iPSCs-NSCs组大鼠Tarlov和Rivlin评分均高于模型组和支架模型组,运动和感觉诱发电位潜伏期均短于模型组和支架模型组,运动和感觉诱发电位振幅均大于模型组和支架模型组(均P<0.05).HE染色显示模型组大鼠脊髓组织受损,组织水肿明显,细胞稀疏;支架模型组大鼠脊髓组织受损程度轻于模型组,组织水肿,细胞稀疏;iPSCs-NSCs组大鼠脊髓组织生长良好,细胞致密,空泡减小,组织水肿消失.结论 UC来源iPSCs-NSCs联合3D打印支架移植可促进ASCI大鼠运动和感觉功能的恢复及受损节段脊神经纤维生长.