牙龈卟啉单胞菌菌毛fimA基因的克隆及表达纯化

摘要

目的 克隆牙龈卟啉单胞菌菌毛fimA基因并使其在大肠杆菌中正确表达.方法 利用PCR方法克隆牙龈卟啉单胞菌fimA基因,构建其原核表达质粒pT-BAD/fimA,获得其在大肠杆菌中的表达,基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定重组蛋白.以不同质量浓度咪唑缓冲液(250、200、150、100、50 μmol·L~(-1))洗脱结合在His-tag纯化柱的目的蛋白,选择最佳洗脱质量浓度.结果 克隆基因测序结果与GeneBank数据库中的序列呈现99.9%同源性;诱导表达后可观察到相对分子量3.8x10~4的融合蛋白,经MALDI-TOF-MS检测进一步证实为FimA蛋白.100 μmol·L~(-1)咪唑缓冲液洗脱得到的蛋白质纯度最高,其纯度为95%.结论 本实验成功克隆了fimA基因,并获得在大肠杆菌中的正确表达,同时得到纯度较高的FimA蛋白,为后续研制增强免疫应答的高效牙周炎真核表达质粒奠定了基础.