肺癌细胞来源的Sema4D通过抑制成骨细胞分化介导肺癌溶骨性骨破坏

摘要

目的 :探讨肺癌来源的信号素4D（semaphorin 4D,Sema4D）在肺癌骨转移溶骨性骨破坏中的作用及机制。方法 :采用免疫组织化学法检测肺癌骨转移灶及正常骨组织中Sema4D的表达情况。分别采用蛋白质印迹法和实时荧光定量PCR法检测4种肺癌细胞株中Sema4D蛋白及mRNA表达水平。收集4种肺癌细胞条件培养液,采用ELISA法检测其中Sema4D的分泌水平。收集Sema4D高表达（PC9细胞）及低表达（A549细胞）肺癌细胞的条件培养液,与成骨前体细胞MC3T3-E1共培养后,采用碱性磷酸酶染色法检测成骨细胞分化水平,采用茜素红染色法检测成骨细胞矿化能力,采用实时荧光定量PCR法检测成骨细胞分化基因如肝/肾/骨型碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, liver/bone/kidney,ALPL）、Oxterix和Ⅰ型胶原α1（collagen typeⅠalpha 1,Col1α1）的表达水平。将Sema4D shRNA转染肺癌PC9细胞后,采用蛋白质印迹法、实时荧光定量PCR及ELISA法分别检测肺癌细胞中Sema4D表达与分泌水平的变化;收集肺癌条件培养液与成骨前体细胞共培养,再次采用碱性磷酸酶染色法、茜素红染色法和实时荧光定量PCR法检测干扰Sema4D表达后肺癌条件培养液对成骨细胞分化的影响。结果:与正常骨组织相比,Sema4D在肺癌溶骨性骨转移灶中高表达。Sema4D在不同肺癌细胞株中呈不同程度的表达与分泌,其中肺癌PC9细胞中表达与分泌水平最高,而肺癌A549细胞中表达与分泌水平最低（P ＜0.05）。肺癌条件培养液可明显抑制成骨前体细胞在成骨诱导剂诱导下的成骨分化,表现为碱性磷酸酶染色及茜素红染色的相对染色面积减小（P值均＜0.05）,成骨分化基因ALPL、Oxterix和Col1α1的mRNA表达水平均明显降低（P值均＜0.05）;并且Sema4D高表达细胞株PC9的条件培养液抑制成骨细胞分化的能力明显强于Sema4D低表达细胞株A549（P ＜0.05）。shRNA转染可显著降低肺癌细胞中Sema4D的表达与分泌水平（P值均＜0.05）,并且使肺癌细胞条件培养液对成骨细胞分化的抑制作用明显减弱（P值均＜0.05）。结论 :肺癌来源的Sema4D通过抑制成骨细胞分化在肺癌溶骨性骨破坏中发挥重要作用,提示其有望成为治疗肺癌骨转移的一个重要靶点。