miR‑10b在体外促进间充质干细胞分化为成骨细胞和抑制其分化为成脂细胞的用途

摘要

本发明涉及miR‑10b在体外促进间充质干细胞分化为成骨细胞和抑制其分化为成脂细胞的用途。具体地，本发明涉及体外诱导间充质干细胞分化为成骨细胞的方法，所述方法包括向间充质干细胞内转染miR‑10b的步骤，其中所述转染的miR‑10b促进间充质干细胞向成骨分化，抑制间充质干细胞向成脂分化。

说明书

技术领域

本发明涉及再生医学的领域，具体而言本发明涉及miR-10b在体外促进间充质干细胞分化为成骨细胞和在体外抑制间充质干细胞分化为成脂细胞中的用途。

背景技术

间充质干细胞(MSC)具有自我更新和多谱系分化潜能，在一定的诱导条件下能够分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞和内皮细胞等[1-3]。成骨细胞和脂肪细胞起源于MSC，MSC向成脂细胞分化和成骨细胞分化是机体普遍存在的两种重要的生理过程，参与了多种组织代谢与平衡的维持[4]。MSC向成脂分化和成骨分化的平衡失调，会引起多种疾病的发生，如骨质疏松症、肥胖症、动脉粥样硬化等，揭示MSC向成脂和成骨分化平衡的调控机制对上述脂肪和骨分化失衡相关疾病的治疗具有重要的指导意义。

microRNA(miRNA)是一类长22nt左右的非编码单链RNA的总称，能够识别特定的靶标mRNA，使之降解或抑制其蛋白质合成，从而发挥调控基因表达的作用[5,6]。miRNA具有靶基因调控的广泛性和功能的多效性，一个miRNA可调控数百个不同的靶基因，单个编码基因的表达也可能受多个miRNA的调控[7]。越来越多的证据表明miRNA能够调控细胞分化和命运决定[8]。据报道，miR-2861、miR-3960、miR-196a、miR-29b、miR-335-5p和miR-216a等可以增强MSC的成骨分化[9-12]，而miR-26a、miR-133、miR-135、miR-141、miR-200a和miR-23a等具有抑制成骨分化的作用[13-16]。miR-143、miR-24、miR-31、miR-30c和miR-642a-3p等则被报道可以调控MSC的脂肪生成[17-20]，少数miRNA被发现参与了MSC成骨和成脂分化平衡的调控，例如miR-204、miR-637、miR-22、miR-17-5p、miR-106a和let-7等[21-26]。这些研究结果提示，miRNA在MSC的成骨和成脂分化调控中可能扮演非常重要的角色。

发明内容

一方面，本发明提供了一种体外诱导间充质干细胞分化为成骨细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

i)在适合脂肪源间充质干细胞生长的培养基中培养所述脂肪源间充质干细胞；

ii)向步骤i)的所述脂肪源间充质干细胞内转染miR-10b后，继续培养24小时；

iii)在步骤ii)中培养的间充质干细胞至亚融合状态时，向培养基中添加10％FBS、10nM地塞米松、0.2mM抗坏血酸和10mMβ-甘油磷酸钠；

iv)继续培养0～12天后，收集并鉴定获得的成骨细胞。

根据本发明所述的方法，其中所述miR-10b促进间充质干细胞向成骨分化，抑制其向成脂分化。

根据本发明所述的方法，其中所述间充质干细胞是脂肪源间充质干细胞；优选地，所述间充质干细胞是成人脂肪源间充质干细胞。

根据本发明所述的方法，其中miR-10b的转染浓度为10～200nmol/L。

根据本发明所述的方法，其中miR-10b的序列如SEQ ID No.1所示。SEQ ID No.1为UACCCUGUAGAACCGAAUUUGUG，其登录号为miRbase Accession number MIMAT0000254。

根据本发明所述的方法，其中用Lipofectamine 2000将miR-10b转染至间充质干细胞，但不限于Lipofectamine 2000。

另一方面，本发明还提供了miR-10b在制备用于体外促进间充质干细胞分化为成骨细胞和抑制所述间充质干细胞分化为脂肪细胞试剂中的用途。

根据本发明的用途，其中所述间充质干细胞是脂肪源间充质干细胞；优选地，所述间充质干细胞是成人脂肪源间充质干细胞。

附图说明

图1：MSC经成骨诱导培养基诱导3天的ALP染色。

图2：MSC经成骨诱导培养基诱导12天的茜素红染色。

图3A：MSC转染NC对照后，经成骨诱导培养基诱导3天的ALP染色。

图3B：MSC转染miR-10b后，经成骨诱导培养基诱导3天的ALP染色。

图4A：MSC转染NC对照后，经成骨诱导培养基诱导12天的茜素红染色。

图4B：MSC转染miR-10b后，经成骨诱导培养基诱导12天的茜素红染色。

图5：成骨诱导后细胞的碱性磷酸酶活性。NC：转染NC的、经过成骨诱导的细胞；miR-10b：转染有miR-10b的、经过成骨诱导的细胞。

图6：MSC经成脂诱导培养基诱导10天的油红O染色。

图7A：MSC转染NC对照后，经成脂诱导培养基诱导10天的细胞的油红O染色。

图7B：MSC转染miR-10b后，经成脂诱导培养基诱导10天的细胞的油红O染色。

图8：成脂诱导后油红O萃取定量分析。NC：转染有NC对照的、经过成脂诱导的细胞；miR-10b：转染有miR-10b的、经过成脂诱导的细胞。

具体实施方式

以下提供了本发明实施方式中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下组织、细胞、试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。

实施例1：成人脂肪源间充质干细胞(hADSCs)的分离和鉴定

1.成人脂肪组织取自吸脂手术患者(中国医学科学院整形医院)，因取材不对患者造成额外伤害，亦不泄露患者的个人信息，已经由中国医学科学院基础医学研究所伦理委员会批准免除知情同意。捐献者均为25～35岁的健康女性。

2.从脂肪组织中分离hADSCs的方法简述如下：

吸脂术采集出来的脂肪组织用D-Hanks洗去血细胞和麻醉药，0.2g/100ml胶原酶P(购自：美国Life Technologies公司)消化1h，之后用D-Hanks洗涤2遍以除去胶原酶。

离心收集细胞，细胞以2×10⁶/ml的密度接种于含58％(v/v)DMEM/F12+40％(v/v)MCDB-201、2％(v/v)胎牛血清、10ng/ml>2、95％湿度的培养箱培养。

两天后换液，弃去未贴壁的细胞，以后每3天半量换液。

当细胞达70％～80％汇合度时，0.25g/100ml胰酶(Gibco)常规消化，细胞按照l:3进行传代。

3.hADSCs的表型：

收集第三代细胞，PBS洗3次；

加0.1％皂素室温破膜1h，PBA洗3次(若检测细胞内抗原，则进行本步骤；若检测细胞表面抗原，则直接进行下一步)；

加一抗(CD29、CD44、CD105、CD31、CD34、CD106、HLA-DR、FLK-1单抗，购自：BD公司)，4℃孵育30min；

加PBS洗3次，加FITC标记二抗(兔抗鼠，购自中杉金桥生物技术有限公司)，4℃孵育30min；

加PBS洗3次，4％多聚甲醛固定，300μl PBS重悬；

流式细胞仪Accuri C6(BD)检测细胞。经鉴定，细胞呈现典型的hADSCs表型：CD29⁺、CD44⁺、CD105⁺、FLK-1⁺；CD31^-、CD34^-、CD106^-、HLA-DR^-。

实施例2：miRNA的转染

1.试剂：

(1)转染试剂为Lipofectamine 2000(Invitrogen)；

(2)待转染的miRNA：

miR-10b模拟物为美国Life Technologies公司合成；

采用公知技术合成与miR-10b长度相似的无关RNA对照(SEQ ID No.2：正义：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，反义：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’)作为阴性对照(negative control，NC)。

2.待转染的miRNA储备液配置：

将装有待转染的miRNA的管低速离心5min，按照Lipofectamine2000(Invitrogen)说明书加入Opti-MEM溶解miRNA，震荡并瞬时离心配成20μM的储备液。

3.细胞准备：

取第3代对数生长期、70％～80％汇合的hADSCs进行转染。

4.转染过程：

用Opti-MEM分别稀释待转染的miRNA和Lipofectamine 2000，轻轻混匀后室温放置5min；

将Lipofectamine 2000稀释液缓慢逐滴加入待转染的miRNA稀释液中，轻轻混匀获得miRNA和Lipofectamine 2000混合液，室温孵育20min；

从培养箱取出待转染细胞，吸出培养液，用DPBS液洗3遍，吸净洗液后每孔加入1.5ml Opti-MEM；

将孵育好的miRNA-Lipofectamine 2000混合液缓慢逐滴加入培养皿中。转染量：miRNA终浓度为10～200nmol/L，轻摇混匀后放培养箱继续培养；

转染6h后，去除转染工作液，用DPBS洗3遍；

更换干细胞培养液，24h后，去除干细胞培养基，用DPBS洗3遍，随后可更换成骨或成脂诱导培养基。

实施例3：hADSCs向成骨诱导分化

分别取第3代的hADSCs(未经转染)、实施例2所获得的细胞(转染有miR-10b、或转染有NC对照)以2×10⁴细胞/cm²的密度接种于T25培养瓶，贴壁过夜后，观察细胞达70％～80％汇合后，更换成骨诱导培养基(H-DMEM培养基中加入10％FBS、10nM地塞米松、0.2mM抗坏血酸和10mMβ-甘油磷酸钠)继续培养，每隔两天半量换液一次。

分别于诱导后的第0、3、6、9天取样，用qRT-PCR和western blot检测成骨表型标志基因在mRNA和蛋白水平的表达变化。

分别于诱导后3天和12天时，用碱性磷酸酶染色和茜素红染色鉴定钙化情况。

实施例4：hADSCs向成骨分化的鉴定

1.碱性磷酸酶染色

1.1实验原理：细胞内碱性磷酸酶在pH 9.4～9.6条件下水解磷酸萘酚AS-MX产生萘酚，后者被重氮盐捕获，生成不溶性蓝色沉淀。

1.2操作步骤：

使用天津血液学研究所碱性磷酸酶染色试剂盒进行碱性磷酸酶染色。

向成骨诱导的培养皿中滴加数滴1号液，室温固定1min，流水漂洗2min；

取2号储备液10ml，加3号液200μl，再加4号粉剂10mg，振摇速溶，用滤纸立即过滤，滤液即工作液：

滴加工作液数滴，置湿盒内于37℃孵育2h，流水冲洗2min；

甘油封片，显微镜下观察照相。

2.茜素红染色

2.1实验原理：茜素红可与钙离子以螯合方式形成复合物。用来识别组织细胞的钙盐成分。通过茜素红染色，产生桔红色沉积(即钙结节)，在细胞外基质中被染成橘红色。细胞本身被染成粉红色。钙盐变化是骨细胞增殖分化和骨组织成骨潜能的标志之一。

2.2操作步骤：

培养皿用PBS冲洗2次，95％乙醇固定10min，去离子水冲洗3次；

0.1％茜素红S(Tris-HCl，pH 8.3)37℃孵育30min；

蒸馏水冲洗；

甘油封片，显微镜下观察照相。

3.碱性磷酸酶(ALP)活性测定

3.1实验原理：ALP与底物pNPP反应，生成黄色物质，通过测定405nm处的吸光度可以反应ALP活性。

3.2操作步骤：

培养细胞去除培养基，冷PBS洗2遍，加适量蛋白裂解液(RIPA裂解液(中)，碧云天生物技术研究所)，冰上裂解30min，收集细胞裂解液；

12000rpm在4℃离心15min；

取5μl细胞裂解液，加入96孔酶标板；

加200μl的碱性磷酸酶底物pNPP(sigma公司)；

37℃孵育30min；

405nm检测吸光值；

计算ALP活性，ALP的活性以细胞裂解液的总蛋白浓度为标准化。

实施例5：hADSCs向成脂诱导分化

分别取第3代的hADSCs(未经转染)、实施例2所获得的细胞(转染有miR-10b、或转染有NC对照)以2×10⁴细胞/cm²的密度接种于T25培养瓶，贴壁过夜后，观察细胞达80％～90％汇合后，更换成脂诱导培养基(H-DMEM培养基中加入10％FBS、10μM地塞米松、50μg/ml抗坏血酸和100μg/ml>

分别于诱导后的第0、3、6、9天取样，用qRT-PCR和western blot检测成脂表型标志基因在mRNA和蛋白水平的表达变化。

于诱导后10天时，用油红O染色测定脂滴的产生。

实施例6：hADSCs向成脂诱导分化的鉴定

1.油红 2染色＃

1.1实验原理：脂肪主要存积于脂肪组织中，并以油滴状的微粒存在脂肪细胞浆内，脂肪被油红O染色，染料被脂肪溶解吸附而呈现染料的颜色。利用染料易溶于脂质的特性证明组织脂质含量的多少。

1.2操作步骤：

油红O原液的配制：用异丙醇配成1mg/ml，避光可长期保存；

工作液的配制：60％的油红O原液加40％去离子水，颠倒混匀，室温静置30min后过滤，现配现用。

1.3染色步骤：

培养皿用D-Hanks洗2次，用中性甲醛室温固定10min；

蒸馏水冲洗2次，每孔加适量油红O工作液，室温染色1h；

蒸馏水冲洗；

显微镜下观察并拍照。

结果：

1.hADSCs(未经转染)经过成骨诱导培养基的诱导，3天后ALP染色呈阳性(图1)，12天后出现茜素红染色阳性的钙结节(图2)。该结果表明，hADSCs在成骨诱导培养条件下，具有成骨分化的能力。

2.miR-10b促进hADSCs成骨分化

(1)图3为ALP染色的结果(图3A为NC对照组、图3B为miR-10b组)。具体而言，从图3A中可见，仅有较少比例的细胞呈ALP染色阳性，图3B显示大部分细胞呈ALP染色阳性。这种差异表明miR-10b与NC相比，可以促进hADSCs成骨分化。

(2)图4为茜素红染色的结果(图4A为NC对照组、图4B为miR-10b组)。具体而言，从图4A中可见，少部分细胞呈茜素红染色阳性，图4B显示大部分细胞呈茜素红染色阳性。这种结果再次证明miR-10b可以促进hADSCs的成骨分化。

(3)经过成骨诱导后，转染有miR-10b的hADSCs ALP活性明显高于转染有NC对照的经过相同时间成骨诱导的hADSCs(图5)。这一结果表明miR-10b与NC相比，可以促进hADSCs成骨分化。

以上结果证实，转染miR-10b后，hADSCs的成骨能力增加。

3.hADSCs(未经转染)经过成脂诱导培养基的诱导，10天后油红O染色呈阳性(图6)。该结果表明，hADSCs在成脂诱导培养条件下，具有成脂分化的能力。

4.miR-10b抑制hADSCs成脂分化

(1)图7为油红O染色的结果(图7A为NC对照组、图7B为miR-10b组)。具体而言，图7A中的被染上橘红色脂滴的细胞数明显多于图7B中的被染上橘红色脂滴的细胞数。这种差异表明miR-10b与NC相比，可以抑制hADSCs成脂分化。

(2)经过成脂诱导后，转染有miR-10b的hADSCs油红O萃取活性明显低于转染有NC对照的经过相同时间成脂诱导的hADSCs(图8)。这一结果表明miR-10b与NC相比，可以抑制hADSCs成脂分化。

以上结果证实，转染miR-10b后，hADSCs的成脂能力减弱。

综上结果证实，miR-10b具有促进hADSCs成骨分化而抑制其成脂分化的作用。

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序列表

<110> 中国医学科学院基础医学研究所

<120> miR-10b在体外促进间充质干细胞分化为成骨细胞和抑制其分化为成脂细胞的用途

<130> 360234CG

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> RNA

<213> miRNA-10b

<400> 1

uacccuguag aaccgaauuu gug 23

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 对照RNA

<400> 2

uucuccgaac gugucacgut t 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 对照RNA

<400> 3

acgugacacg uucggagaat t21