大鼠Adrb3基因重组慢病毒干扰载体的构建及其对血管平滑肌细胞Adrb3表达的影响

摘要

目的 构建大鼠Adrb3(rAdrb3)基因慢病毒干扰载体,筛选高效率rAdrb3基因干扰序列,观察其对大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)Adrb3基因表达的影响,为进一步研究Adrb3在心力衰竭中的作用机制提供实验工具.方法设计2条rAdrb3基因shRNA寡核苷酸序列,构建慢病毒干扰质粒并进行测序鉴定.三质粒法共转染293T细胞包装慢病毒,测定慢病毒滴度.大鼠VSMC设置正常对照组(Normal组),空载慢病毒组(Lv-rAdrb3-shRNA-control组),携带rAdrb3基因慢病毒干扰载体1组(Lv-rAdrb3-shRNA-1组),携带rAdrb3基因慢病毒干扰载体2组(Lv-rAdrb3-shRNA-2组),感染5 d后,收集细胞.提取细胞总RNA和蛋白,Real-time PCR检测rAdrb3 mRNA表达,Western blot检测rAdrb3蛋白表达.结果构建2个携带rAdrb3基因慢病毒干扰载体,滴度均为2×108 TU/mL.慢病毒感染大鼠VSMC 72 h后,感染效率可达80％.与Normal组比较,Lv-rAdrb3-shRNA-1、Lv-rAdrb3-shRNA-2组Adrb3 mRNA水平沉默效率为87.18％、65.27％(P<0.05);与Normal组比较,Lv-rAdrb3-shRNA-1、Lv-rAdrb3-shRNA-2组rAdrb3蛋白水平沉默效率为85.57％、70.04％(P<0.05).结论成功构建并筛选出有效携带rAdrb3基因慢病毒干扰载体,可显著抑制大鼠VSMC Adrb3的表达.