含hTK1和hTIMP1双基因共表达重组腺病毒载体的构建及对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

摘要

目的:本课题前期研究发现腺病毒介导的组织激肽释放酶1(hTK1)基因过表达具有部分抑制血管平滑肌细胞增殖和改善血管再狭窄的作用,但联合基质金属蛋白酶组织抑制物(TIMP)对血管平滑肌细胞增殖是否具有协同效应,目前尚不明了。本课题首先构建含hTK1和hTIMP1双基因共表达的重组腺病毒载体和含基因hTIMP1的重组腺病毒载体,并检测病毒滴度。随后观察比较双基因共表达载体与单基因表达载体,转染原代培养血管平滑肌细胞(VSMCs)后,测定其感染率以及对血小板源性生长因子(PDGF-BB)诱导VSMCs增殖的影响。
　　方法:
　　第一部分:
　　1、由Invitrogen公司购买含hTIMP1基因的原始质粒,经鉴定后,选择相对应内切酶,酶切hTIMP1基因片段和含强绿色荧光蛋白基因(EGFP)穿梭质粒pDC316-EGFP,经连接热激、转化及构建含hTIMP1和EGFP基因的重组穿梭质粒,经PCR、酶切和测序分析进行鉴定。
　　2、对含hTIMP1重组穿梭质粒应用限制性内切酶BgⅢ/SaⅡ,进行酶切并扩增、回收含启动子cmv的片段cmv-hTIMP1片断,选择对应酶切位点同时酶切质粒pDC316-hTK1载体(本研究室保存)并回收,并将上述产物进行连接、热休克法转染感受态大肠杆菌DH-5ɑ后挑取正确克隆,构建含双启动子和双基因的重组穿梭质粒。经PCR、酶切分析和测序分析进行鉴定该质粒。
　　3、将上述两个重组穿梭质粒线性化,并同腺病毒骨架质粒pBHGloxE1,3Cre转染293A细胞,在293A细胞包装含hTIMP1基因和hTK1和hTIMP1双基因的重组腺病毒载体,并经PCR鉴定毒种中的目的基因;以经典TICD50法测定病毒滴度。
　　第二部分:
　　1、组织块贴壁法体外培养Sprague-Dawley(SD)大鼠胸主动脉VSMCs,观察细胞生长状态并用Alpha Smooth Muscle Actin单克隆抗体经细胞免疫组化法鉴定正确性。
　　2、荧光显微镜和流式细胞仪检测重组腺病毒感染率。
　　3、细胞计数法和四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法分别检测细胞增殖改变。
　　结果:
　　第一部分:
　　1、经PCR法、双酶切法和测序三种方法检测证实,含hTIMP1和EGFP的重组穿梭质粒pDC316-hTIMP1-EGFP,和含hTK1和hTIMP1基因的pDC316-cmv-hTK1-cmv-hTIMP1构建正确。
　　2、上述两个重组穿梭质粒分别与骨架质粒pBHGloxE1,3Cre在293A细胞中成功包装了含hTIMP1的Ad5-hTIMP1-EGFP重组腺病毒载体,和含hTK1和hTIMP1基因的Ad5-hTK1-hTIMP1重组腺病毒载体,并经毒种PCR证实了目的基因正确性。
　　3、经TICD50法测定两种重组腺病毒滴度:Ad5-hTIMP1-EGFP为7.0×1011vp/ml,Ad5-hTK1-hTIMP1为8.5×1011vp/ml。
　　第二部分:
　　1、成功原代培养了大鼠VSMCs,细胞呈梭形、纺锤形,7-10天,细胞彼此融合,呈束状排列,部分出现旋窝“峰和谷”样的生长模式:经细胞免疫组化鉴定胞浆内a-SM免疫荧光阳性表达,呈红色丝状条纹,说明培养的细胞是血管平滑肌细胞,纯度达95％以上,VSMCs纯度高。
　　2、Ad5-hTK1-EGFP转染细胞后,感染率呈浓度(20-100MOI)和时间(1-4d)依赖性增加,在100MOI和第4天时最高感染率为99.57%;Ad5-hTIMP1-EGFP的感染率同样呈浓度(20-150MOI)和时间(1-5d)依赖性增加,在150MOI和第5天时,最高感染率为98.14%。
　　3、细胞计数法和MTT法结果显示:与control组相比,PDGF-BB可明显促进细胞增殖生长(P<0.01);对照病毒组与单纯PDGF-BB诱导组的细胞增殖无明显差异;三种重组腺病毒Ad5-hTK1-EGFP、Ad5-hTIMP1-EGFP和Ad5-hTK1-hTIMP1呈时间(2-5d)依赖性和感染复数(20-150MOI)依赖性抑制PDGF-BB诱导VSMCs增殖;含双基因腺病毒载体的抑制效应明显强于单基因腺病毒(Ad5-hTK1-EGFP和Ad5-hTIMP1-EGFP)(p<0.01),在第5天150MOI时的抑制率达50.97%。
　　结论:
　　1、本研究通过双启动子策略,首次成功构建和包装含hTK1和hTIMP1双基因的共表达重组腺病毒载体Ad5-hTK1-hTIMP1,同时成功构建含hTIMP1的重组腺病毒载体Ad5-hTIMP1-EGFP;
　　2、转染VSMCs后,Ad5-hTIMP1-EGFP的感染率呈浓度(20-150MOI)和时间(1-4d)依赖性增加;
　　3、双基因共表达载体可抑制PDGF-BB诱导VSMCs的生长和增殖,含双基因(hTK1和hTIMP1)共表达载体的抑制效应明显大于单基因(hTK1或hTIMP1)载体,这为联合基因在心血管的基因治疗中奠定初步实验基础。

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前言

第一部分 构建含hTK1和hTIMP1双基因的重组腺病毒载体及滴度测定

一 实验材料

二 主要试剂配制及准备

三 实验方法

讨论

第二部分 双基因共表达载体对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

一 实验材料

二 实验方法

三 实验结果

讨论

结 论

参考文献

综述

致谢