2种Heymann肾炎受体相关蛋白融合蛋白的制备及其意义

摘要

目的:构建Heymann肾炎致病原受体相关蛋白(RAP)全长和羧基端多肽的原核融合表达载体,表达并纯化相应的融合蛋白.方法:通过RT-PCR法获得RAP全长的cDNA,将其与pGEM-T克隆载体连接并转化,对阳性克隆进行测序分析,设计针对RAP全长和羧基端带有EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切位点的特异引物,通过PCR合成RAP全长359个氨基酸和羧基端108个氨基酸的DNA.纯化后与含有GST的pGEX-4T-1载体体外重组连接,亚克隆到感受态细胞BL21中,经IPTG诱导,表达的融合蛋白通过GST-Sepharose 4B亲和层析法纯化,并经SDS-PAGE和Western Blot检测.结果:酶切分析、PCR及DNA序列测定结果表明成功构建了重组原核表达载体pGEX-4T-1-RAP1083和pGEX-4T-1-RAP324,含有重组质粒的大肠杆菌BL21经诱导后表达出RAP全长70 ku和羧基端40 ku的融合蛋白.Western Blot结果显示分别在分子质量70ku、40ku处出现特异性条带,与理论相符.结论:成功构建了RAP1083、RAP324与pGEX-4T-1融合基因表达载体,融合蛋白在大肠杆菌中高效表达,为后续研究Heymann肾炎的分子发病机制奠定了基础.