G蛋白偶联受体56胞外端融合蛋白的表达、纯化及其多克隆抗体的制备

摘要

目的:制备G蛋白偶联受体56(G protien-coupled recepter 56,GPR56)的高效抗体,为其功能及分子机制的深入研究提供灵敏、高效的免疫学检测工具.方法:以肝癌细胞株MHCC-97H的cDNA为模板,利用PCR技术扩增GPR56 N端序列(661～1 073 bp),并构建重组表达载体pGEX4T-1-GPR56N.阳性克隆经酶切、测序鉴定正确后,转化大肠杆菌BL21进行诱导表达.表达产物经Western blot初步鉴定后,用GST磁珠分离纯化,纯化后蛋白与免疫佐剂混合直接免疫家兔制备抗血清.阳性血清用 ELISA、Western blot、免疫组织化学等技术对细胞或组织中的GPR56进行鉴定和分析.结果:成功构建重组表达载体pGEX4T-1-GPR56N,GPR56N与GST的融合蛋白(GST-GPR56)在原核系统中进行了高效的可溶性表达,制备的兔抗人GPR56抗体经Western blot和免疫组织化学分析结果表明,该抗体可同时对人源性和鼠源性的GPR56进行特异性检测.结论:成功对GPR56蛋白N端序列进行了原核表达和纯化,制备的抗GPR56多克隆抗体具有较高的特异性,为GPR56功能及分子机制的深入研究奠定了坚实的基础.