一种新型葡激酶分子的设计基因构建表达纯化及性质研究

摘要

在葡激酶构效关系的研究过程中发现,葡激酶易形成二聚体,甚至多聚体,不利于葡激酶的临床应用.为了探究聚合体的形成机制以研制不易聚合的新型葡激酶分子,在葡激酶X射线晶体衍射结构模型的基础上,采用分子对接软件GRAMM V1.03,以高分辨率整体对接方式预测了葡激酶二聚体可能的结合区.结合区主要有两种可能的形成方式,通过强疏水相互作用及氢键结合.根据模型设计了旨在降低聚合能力的葡激酶突变体RGD-Sak,将F111置换为D111,并且改变K109为R109,恰好使分子中形成RGD结构,使新型分子还可能具有抑制血小板聚集作用.利用定点突变及DNA重组技术,构建了RGD-Sak基因,并利用大肠杆菌原核表达系统进行了高效表达.RGD-Sak以包涵体形式存在,包涵体经洗涤,8mol/L尿素溶解,稀释复性,离子交换色谱一步分离得到电泳纯的RGD-Sak,纯度达95%以上,分子量与理论值相符,比活性5×104 Hu/mg.RGD-Sak与纤溶酶形成的复合物催化纤溶酶原的Km、Kcat值分别为12.40μmol/L、0.81 s-1.RGD-Sak显示了很弱的聚合能力.此研究为研制防止二聚体形成的新型葡激酶分子打下了基础.