基于间接ELISA的鲤血清CyHV-3 pORF65抗体检测方法的建立

摘要

鲤疱疹病毒3型（cyprinid herpesvirus 3,Cy HV-3）囊膜蛋白ORF65基因全长1 785 bp,编码594个氨基酸。该研究在稀有密码子分析及信号肽与跨膜结构预测的基础上,将p ORF65中的N端信号肽与C端跨膜区段删除后进行密码子优化与基因合成,将合成的截短ORF65（truncated ORF65）插入p ET32a（＋）载体,构建了p ET32a-trun ORF65;进一步采用DNAstar、ABCpred、Bepi Pred 1.0软件预测了p ORF65的5个B细胞表位优势区段,以合成的截短ORF65为模板,通过SOE-PCR将5个B细胞表位优势区段编码序列融合后插入p ET32a（＋）载体,构建了p ET32a-mod ORF65。重组质粒分别转入BL21（DE3）菌株,经IPTG诱导,SDS-PAGE和Western-blot分析,p ET32a-mod ORF65获得高效表达,表达的融合蛋白分子量为56.4 k D。此外,利用r Protein G亲和层析纯化了锦鲤（Cyprinus carpio haematopterus）血清Ig M,免疫小鼠,制备了鼠抗锦鲤Ig M多克隆抗体。在上述研究的基础上,将纯化的p ORF65作为包被抗原,鼠抗锦鲤Ig M多克隆抗体作为检测抗体,建立了间接ELISA方法,该方法可以检测p EGFP-ORF65 DNA疫苗免疫锦鲤后产生的特异性抗体。