猪戊型肝炎病毒血清抗体间接ELISA检测方法的建立与应用

摘要

戊型病毒性肝炎（Hepatitis E）是由戊型肝炎病毒（Hepatitis E Virus, HEV）引起的一种人畜共患病，猪是其自然储存宿主。因此猪群中 HEV 感染的监控对该病的防控和公共卫生都具有重要的意义。目前对猪 HEV 感染的检测技术主要包括免疫电镜、巢式RT-PCR和ELISA方法。其中ELISA因其快速且方便的优点，得到了广泛应用。 目前，我国市场上猪HEV抗体检测的商品化试剂盒多数是以基因1型HEV ORF2或ORF3蛋白为包被抗原建立的ELISA方法。然而，一方面，我国猪群中HEV主要以基因4型为主；另一方面，有研究表明不同基因型ORF2蛋白检测猪血清中HEV抗体差异显著，从而导致不同试剂盒相互之间检测结果符合率低。因此，急需建立一种准确性、敏感性高和特异性好的ELISA方法，为猪群中HEV感染的监控提供技术支撑。本课题利用我国猪群中流行的基因4型猪HEV ORF2蛋白为包被抗原，从而提高建立的ELISA方法对我国猪群中猪HEV抗体检测的特异性和敏感性。通过优化反应条件，建立了猪HEV抗体间接ELISA检测方法，并分析了该方法的敏感性、特异性、重复性以及与商品化试剂盒的符合率，评价其临床应用。 SDS-PAGE结果表明目的蛋白在大肠杆菌中成功表达，大小约为40 ku，且以包涵体形式存在，通过蛋白复性和分子筛纯化后，获得纯度较高的目的蛋白，用猪 HEV 阳性血清作为一抗，Western blot结果证明纯化的sHEV-ORF2-C蛋白抗原性较好，可作为建立ELISA方法的包被抗原。优化ELISA条件，最终确定，抗原最佳包被量为200 ng/孔，血清最佳稀释度为1:200，包被缓冲液为碳酸盐缓冲液（pH 9.6），最佳封闭条件为2.5%的脱脂奶粉37℃封闭2 h，酶标二抗5000倍稀释后作用1 h，TMB显色液作用10 min。用该方法对91份HEV阴性血清进行检测，确定临界值为0.296。其它重要猪疫病的阳性血清及猪HEV阴性血清的OD450小于 0.296，表明该间接ELISA方法的特异性良好。对阳性血清做倍比稀释，当1:12,800稀释时，OD450值小于0.296，表明该方法敏感性良好。板内重复试验和板间重复试验变异系数为5%和10%，表明建立的间接ELISA方法具有很好的重复性和稳定性。用本研究建立的 ELISA 方法和北京万泰商品化试剂盒同时检测182份临床猪血清，其中建立的ELISA方法检测阳性93份，阴性89份；北京万泰商品化试剂盒检测阳性77份，阴性105份，与北京万泰商品化试剂盒符合率为91.2%。对来自各地市猪场送检的477份临床猪血清进行检测，检出抗体阳性样品210 份，阳性率为44.03% (210/477)，表明该方法可用于临床猪血清中猪HEV抗体的检测。因此，本研究建立的猪HEV抗体间接ELISA检测方法，敏感性、特异性良好，准确率较高，适用于临床样品的检测和血清流行病学调查。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1 HEV的研究进展

1.1.1 HEV的分子生物学

1.1.2 HEV的流行病学

1.1.3 HEV的诊断

1.1.4 戊型肝炎的预防与控制

1.2 本研究的目的与意义

第二章猪HEV ORF2重组蛋白sHEV-ORF2-C的原核表达及纯化

2.1 材料

2.1.1 载体与菌株

2.1.2 主要试剂

2.1.3 主要仪器设备

2.2 实验方法

2.2.1 PCR扩增目的片段

2.2.2 PCR产物回收

2.2.3 PCR产物酶切及连接

2.2.4 连接产物转化

2.2.5 阳性菌落筛选

2.2.6 重组质粒转化

2.2.7 诱导表达及可溶性分析

2.2.8 表达蛋白复性

2.2.9 表达蛋白纯化

2.2.10表达蛋白western blot分析

2.3重组质粒的构建及鉴定结果

2.3.1 扩增目的片段的结果

2.3.2表达产物的SDS-PAGE和Western blot分析

2.4 讨论

第三章基于猪HEV ORF2截短蛋白间接ELISA方法的建立及初步应用

3.1 材料

3.1.1 蛋白和临床血清

3. 1.2 主要试剂

3.1.3 主要仪器

3.2 方法

3.2.1 ELISA检测操作流程

3.2.2 确定抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度

3.2.3 确定抗原最佳包被时间

3.2.4 确定最佳包被缓冲液和封闭液

3.2.5 确定封闭最佳时间

3.2.6 确定待检血清最佳反应时间

3.2.7 确定酶标二抗最佳稀释度及反应时间

3.2.8 确定底物最佳显色时间

3.2.9 确定临界值

3.2.10 特异性试验

3.2.11 敏感性试验

3.2.12 重复性试验

3.2.12 准确性试验

3.2.13 临床检测

3.3 结果

3.3.1 抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定

3.3.2 抗原最佳包被时间的确定

3.3.3 最佳包被缓冲液和封闭液的确定

3.3.4 封闭最佳时间的确定

3.3.5 一抗血清最佳反应时间的确定

3.3.6 酶标二抗最佳稀释度及反应时间的确定

3.3.7 底物最佳显色时间的确定

3.3.8 临界值的确定

3.3.9 特异性试验

3.3.10 敏感性试验

3.3.11重复性试验

3.3.12 准确性试验

3.3.13 临床样品检测

3.4 讨论

结论

参考文献

致谢

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