麻疯树AP2/ERF基因家族孤儿基因Soloist的克隆与原核表达分析

摘要

[目的]含有AP2结构域的AP2/ERF蛋白是与植物抗逆性密切相关的转录因子家族,Soloist是AP2/ERF家族中的孤儿基因,大部分植物只有1个.克隆麻疯树该基因编码框的全长cDNA序列,并对其理化性质、基因结构、启动子区域调控元件、表达特性及蛋白原核表达进行分析,为深入开展麻疯树Soloist基因的功能鉴定及其在麻疯树遗传改良中的应用提供依据.[方法]利用AP2结构域的隐马尔可夫模型结合拟南芥与水稻的Soloist蛋白序列对麻疯树蛋白质数据库进行相似性检索,经过Pfam与CDD在线工具的验证获得麻疯树AP2/ERF基因家族成员.利用不同的工具对Soloist基因进行生物信息学对比分析.通过实时荧光定量PCR检测该基因在麻疯树不同器官及低温处理下的相对表达量.通过双酶切构建该基因的原核表达载体,并转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株进行IPTG诱导表达,分别收集不同诱导时间段的菌液,SDS-PAGE检测融合蛋白的表达情况.[结果]共鉴定到119个麻疯树AP2/ERF家族基因,其中包含1个Soloist基因,命名为JcSoloist.序列分析显示,麻疯树JcSoloist基因编码框长度为699 bp,编码232个氨基酸,预测分子量为26.3 kDa,理论等电点为9.65,包含6个外显子与5个内含子.在其基因启动子序列中鉴定到TATA框、CAAT框,以及赤霉素、水杨酸及干旱等应答元件.表达分析显示,麻疯树Jcsoloist基因在麻疯树各器官中都有表达,但表达水平具有器官特异性,在根中表达量较高,而在叶片中表达量相对较低,同时,在叶片与根中都属于低温诱导表达基因,分别在低温胁迫3h与24h达到最大表达量,较对照提高34.38倍与3.83倍.构建了pET-32a-JcSoloist重组载体,且在原核细胞中稳定表达,SDS-PAGE结果显示融合蛋白分子量为46.0 kDa,与预期大小一致.[结论]麻疯树AP2/ERF基因家族鉴定到1个Soloist基因,包含由3条反平行β-折叠与1条α-螺旋组成的AP2结构域,与其他物种的报道一致.基因启动子区域鉴定到赤霉素、水杨酸等顺式作用元件,暗示该基因在麻疯树激素信号转导中发挥重要作用.JcSoloist基因在麻疯树叶片与根中受低温诱导表达显著,说明该基因参与麻疯树低温响应过程以及低温信号转导途径,也成为麻疯树抗冷新品种选育的候选基因.