落叶松胚性愈伤组织悬浮培养体系的优化

摘要

[目的]以落叶松胚性系为研究对象,建立和优化适合落叶松胚性愈伤组织增殖的悬浮培养体系,在此基础上对悬浮组织进行体细胞胚的成熟诱导.旨在为实现落叶松胚性愈伤组织的快速增殖及体细胞胚的规模化繁育奠定基础.[方法]对已诱导获得的长白落叶松、兴安×日本杂种落叶松及日本×长白杂种落叶松胚性愈伤组织进行继代培养,取新鲜增殖的组织进行悬浮培养.采用L9(34)正交试验设计,以胚性愈伤组织的增殖量及增殖率为响应值对悬浮培养条件进行筛选和优化,并对选出的最适培养条件进行验证.以悬浮增殖的胚性组织进行体细胞胚成熟培养,统计体胚发生量.[结果]在落叶松胚性愈伤组织的悬浮培养过程中,接种量、震荡强度及培养时间对胚性组织增殖具有显著的影响.在一定范围内,落叶松胚性组织的增殖量及增殖率随初始接种量的增加而降低,随震荡强度的升高呈先增加后下降,而随培养周期的延长而增加.以4 g·L-1接种于含2,4-D 0.15 mg·L-1、6-BA 0.05 mg·L-1及KT 0.05 mg·L-的BM培养基(SCM),在120 r·min-1避光条件下悬浮培养,3个落叶松胚性系的胚性组织均能快速、稳定地增殖,培养15天的增殖率分别为2 569.42％、4 189.96％及3 001.67％,表现出较明显的种间差异.成熟培养方式对落叶松胚性悬浮组织的体胚发生量影响极显著(P=0.000).悬浮培养获得的胚性组织接种到含琼脂6.0g·L-1的固体增殖培养基(PCM)上继代15天后,转接到添加肌醇10 g·L-1且无生长调节剂的1/4BM过渡培养基(TCM)上培养14天,再转入含有ABA 20 mg·L-1、AgNO35 mg·L-1、PEG4000 80 g·L-1的体胚成熟培养基上培养8周,体胚发生量显著提高(P=0.000).在此条件下,3个落叶松胚性系OO-A1、GK-F1及KO-H的体胚发生量分别为(101.69±11.19)、(93.09±9.34)及(5.78±1.47)个·g-1.[结论]悬浮培养能在短期内获得大量分散均匀、质量较高的落叶松胚性愈伤组织,且不会影响体细胞胚的发生和成熟.在BM液体培养基(SCM)中,接种量为4g·L-1、震荡强度为120 r·min-1、暗培养15天,落叶松胚性组织的鲜质量可增加26.99～42.90倍.悬浮培养获得的胚性组织经固体增殖培养基(PCM)继代15天及过渡培养基(TCM)预培养14天后,再进行体胚成熟诱导可明显提高其体胚发生量.