兴安落叶松胚性愈伤组织诱导研究

摘要

兴安落叶松(Larix gmelinii)是我国东北地区主要的造林树种，近年来对其优良种源的需求逐渐增大。而由于其结实量不稳定且种子具有休眠特性，难以满足目前的生产需求。因此，本研究以成熟和未成熟合子胚为材料，系统研究了兴安落叶松胚性愈伤组织诱导的影响因素，以期确立高效、稳定的兴安落叶松胚性细胞系，并为其体胚发生体系的建立提供实验依据。主要结果如下： (1)以成熟合子胚为材料的诱导过程中发现，种源、培养基类型、激素种类、低温处理以及带胚乳与否，都对兴安落叶松胚性愈伤组织的诱导产生了明显的影响。内蒙种源诱导率显著高于加格达奇种源的诱导率(p<0.05)，S培养基优于MS、DCR及其它几种培养基，2,4-D的诱导作用远大于NAA，经过低温处理(4℃，1个月)的成熟种子以及带胚乳培养都有利于诱导。 (2)未成熟合子胚的胚性愈伤组织诱导与外植体采集的时间关系密切。在6月中上旬取材的外植体诱导率为0；而6月下旬～7月上旬取材的外植体(即，处于前子叶期、子叶初期)，胚性愈伤组织的平均诱导率高(33.92％，40.19％)，且胚性愈伤组织状态好，7月下旬以后随着合子胚发育逐渐成熟，胚性愈伤组织的诱导率明显下降。 (3)不同激素组合和浓度配比对胚性愈伤组织诱导率影响不同，且合子胚不同发育时期受激素作用的程度也不相同，处于胚胎选择时期的外植体，无论激素浓度是多少，胚性愈伤组织诱导率都是0，而前子叶期胚在1 mg/L2,4-D、0.1 mg/LBA、0.5 mg/LKT时达到最高的诱导率(53.71％)。试验还发现2,4-D起主要作用，但是BA、KT的加入可显著提高胚性愈伤组织的诱导率。此外，当琼脂浓度为4 mg/L时，胚性愈伤组织的诱导率最高。 (4)选择合适的继代时间对胚性愈伤组织的增殖影响也较大，当愈伤组织培养17～24 d时，继代于琼脂浓度为5 g·L<'-1>的培养基中效果较好，时间过长可能使胚性愈伤组织失去胚性而不能进一步生长发育。增殖阶段仍就需要一定量的激素，首次继代培养在添加0.5 mg/L、2,4-D、0.05 mg<,-1>BA和0.25 mg/LKT时效果最好，增长量可以达到1.5 g，而后激素浓度降低至原来的的十分之一。若直接转接到无激素的培养基中，外植体将褐化死亡。 (5)成熟培养基中加入适量浓度的ABA(2 mg/L)，胚性愈伤组织就会分化出柱状后期原胚。添加适量的PEG、肌醇也可以起到促进分化的作用，但是体胚的生长状态不好，也没有分化出子叶胚；ABA和PEG合用，无明显效果。将子叶形胚转移到不含任何激素的萌发培养基S中5～7 d后，子叶由黄白色转变为绿色，且逐渐张开，下胚轴伸长，但生根情况不好。

目录

文摘

英文文摘

声明

1绪论

1.1植物体细胞胚发生及细胞学研究基础

1.1.1植物体细胞胚胎发生的研究概况

1.1.2植物体细胞胚胎发生的细胞学基础

1.2落叶松体细胞胚胎发生的研究进展

1.2.1落叶松体细胞胚胎发生的研究现状

1.2.2落叶松体细胞胚胎发生的过程

1.2.3影响落叶松体细胞胚胎发生的主要因素

1.2.4落叶松体细胞胚的生理生化研究

1.3落叶松体细胞胚胎发生研究的发展方向及应用前景

1.3.1超低温保存

1.3.2原生质体培养

1.3.3基因转化

1.4课题的目的和意义

2材料与方法

2.1实验材料

2.1.1材料灭菌

2.1.2实验设计

2.1.3培养环境条件

2.1.4观察与数据分析

3结果与分析

3.1灭菌剂种类、浓度及处理时间对外植体消毒效果的影响

3.2胚性愈伤组织诱导培养阶段

3.2.1不同接种方式对兴安落叶松胚性愈伤组织诱导的影响

3.2.2基本培养基对兴安落叶松胚性愈伤组织诱导的影响

3.2.3种源及冷藏处理对兴安落叶松胚性愈伤组织的影响

3.2.4 2,4-D、NAA的浓度对兴安落叶松胚性愈伤组织诱导的影响

3.2.5取材时期对兴安落叶松胚性愈伤组织的影响

3.2.6激素种类和浓度对兴安落叶松胚性愈伤组织的影响

3.2.7琼脂浓度对兴安落叶松胚性愈伤组织诱导的影响

3.3兴安落叶松胚性愈伤组织增殖阶段培养

3.3.1继代时间对兴安落叶松胚性愈伤组织增殖效果的影响

3.3.2激素浓度对兴安落叶松胚性愈伤组织增殖效果的影响

3.3.3琼脂浓度对兴安落叶松胚性愈伤组织增殖效果的影响

3.3.4愈伤组织的种类及特点

3.4兴安落叶松体细胞胚成熟、萌发阶段的培养

3.4.1 ABA对兴安落叶松体细胞胚成熟的影响

3.4.2 PEG、肌醇对兴安落叶松体细胞胚成熟的影响

3.4.3兴安落叶松体细胞胚萌发阶段培养

4讨论

4.1外植体的消毒

4.2兴安落叶松胚性愈伤组织的诱导

4.2.1外植体与胚性愈伤组织的诱导

4.2.2基本培养基与胚性愈伤组织的诱导

4.2.3激素种类、浓度与胚性愈伤组织的诱导

4.2.4琼脂浓度与胚性愈伤组织的诱导

4.3兴安落叶松的胚性愈伤组织的增殖

4.4兴安落叶松胚性愈伤组织的成熟与萌发

结论

1主要结论

2本研究的创新点

3存在问题及建议

图版

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

致谢