柑橘脉突病毒基因组全长cDNA克隆及其侵染性鉴定

摘要

[目的]构建柑橘脉突病毒(citrus vein enation virus,CVEV)侵染性克隆,为从分子水平解析其致病机理打下基础.[方法]利用SMARTer(R) RACE(rapid amplification of cDNA ends)试剂盒对CVEV的5'序列进行RACE,并依据序列分析结果及CVEV分离株VE-1保守序列,设计CVEV基因组全长cDNA扩增引物.以CVEV毒源植株的总RNA为模板,通过EV25-F/EV5983-R引物扩增CVEV基因组全长cDNA.利用In-Fusion重组连接线性化pXT1和CVEV全长cDNA.通过菌液PCR及测序分析鉴定CVEV基因组全长cDNA克隆.通过农杆菌介导的真空浸润接种摩洛哥酸橙(Citrus aurantium)、邓肯葡萄柚(C.paradisi)、尤力克柠檬(C.limon)、枳柚(C.paradisi × Poncirus trifoliata)、Rusk枳橙(P.trifoliata× C.sinensis)、枣阳心叶枳(P.trifoliata),进一步通过RT-PCR检测、症状观察鉴定所构建CVEV全长cDNA克隆的侵染性.[结果]建立了CVEV的基因组全长RT-PCR扩增体系,获得基于双元载体pXT1的CVEV基因组全长cDNA克隆1 0个.随机选取的6个全长cDNA克隆CVEV1901-CVEV1906的序列一致性为99.35％.其中,CVEV1901基因组全长5 983 nt,由5个开放阅读框、5'端207 nt和3'端198 nt的两个非翻译区、以及0RF2和0RF3之间122 nt的基因间隔区组成.序列分析结果显示,CVEV1901与浙江分离株XZG及四川SM分离株的序列一致性分别为99.98％和99.11％;与西班牙VE-1分离株、美国加州VE701分离株和日本IBK分离株基因组序列一致性在96.89％-98.61％;与同属中豌豆耳突花叶病毒(pea enation mosaic virus)和紫花苜蓿耳突病毒(alfalfa enamovirus)的序列一致性约90％.通过农杆菌介导的真空浸润将CVEV1901接种至6个不同的柑橘品种,接种后120 d的RT-PCR检测结果表明摩洛哥酸橙、邓肯葡萄柚、尤力克柠檬、枳柚、Rusk枳橙和枣阳小叶枳阳性植株/接种植株(阳性率)分别为16/17(94.12％)、12/14(85.71％)、16/21 (76.19％)、15/19 (78.95％)、13/14 (92.86％)和0/18 (0).其中,部分摩洛哥酸橙出现典型CVEV侵染症状,叶片侧脉和支脉产生耳状小突起,叶背有相应的凹陷;部分邓肯葡萄柚和尤力克柠檬出现叶片皱缩现象.[结论]建立了CVEV的基因组全长RT-PCR扩增体系,获得了CVEV基因组全长cDNA侵染性克隆,通过农杆菌介导的真空浸润接种可引起摩洛哥酸橙、邓肯葡萄柚和尤力克柠檬的CVEV侵染症状.