猪卵母细胞冷冻保存研究

摘要

[目的]本研究试图通过比较猪卵母细胞超低温冷冻保存方法、冷冻承载工具、冷冻卵母细胞的类型,从而有效地保存猪卵母细胞;[方法]利用屠宰场卵巢采集的卵母细胞,以台盼蓝染色、二乙酸荧光素(FDA)染色鉴定卵母细胞冷冻后的成活率,以体外成熟和体外受精鉴定卵母细胞冷冻后的发育能力,研究了不同冷冻方法和不同冷冻保护剂对猪卵母细胞的冷冻效果.[结果](1)程序化法冷冻保存中,9%乙二醇(EG),10%二甲基亚砜(DMSO),10%甘油(Gly)均对猪MII期卵母细胞有冷冻保护作用,极显著高于对照组(FDA染色成活率33.8%,25.8%,23.5% vs 2.5%,P <0.01),且以9%EG的效果最好,显著高于另外两组( 33.8% vs 25.8%,23.5%, P <0.05).(2)玻璃微细管(GMP)法是猪卵母细胞超低温冷冻的较好方法,以普通的麦管(Straw)法进行的程序化冷冻为对照组,GMP管法显著提高猪卵母细胞的冷冻成活率(分别为63.3%和34.5%,P<0.05).(3)在玻璃化冷冻方法中,不同的冷冻液载体对猪卵母细胞冷冻成活率有影响.以EFS40为冷冻液,Straw和GMP管作冷冻液载体,卵母细胞的成活率分别为45.0%和65.9%,二者差异显著(P <0.05).(4)用Straw的程序化冷冻法和用GMP管的玻璃化冷冻法对猪GV期卵母细胞冷冻均有效,但二者差异显著(成活率分别为30.0%和59.7%,P<0.05).冷冻后继续培养,分别有2.8%和6.3%的卵母细胞周围颗粒层发生扩散.(5)冷冻对MII期卵母细胞的发育潜能影响较大,用新鲜精液使其受精,仅有4.9%的受精卵分裂,极显著低于对照组的49.5%(P<0.01);发育至4-细胞期的比例为1.7%,但未能发育至8-细胞期以上胚胎.[结论]选用MⅡ期卵母细胞、以GMP管为冷冻承载工具、应用玻璃化冷冻方法能够较好地保存猪卵母细胞,为进一步完善猪卵母细胞超低温冷冻保存技术体系提供了参考依据.