棉花咖啡酸-O-甲基转移酶基因的克隆及特征分析

摘要

[目的]克隆棉花木质素合成关键酶基因GhCOMT1、GhCOMT2和GhCOMT3全长cDNA序列,分析其在不同组织部位的表达情况并进行原核表达研究.[方法]根据棉花纤维特异表达cDNA文库分析得到的EST序列设计引物,采用RT-PCR技术克隆基因,用生物信息学方法对获得的cDNA序列及推定的氨基酸序列进行分析.采用半定量RT-PCR方法研究GHCOMT1、GhCOMT2和GhCOMT3在不同组织中的表达.构建了基因的原核表达载体,经酶切鉴定后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中并诱导表达.[结果]从发育的棉花纤维中克隆了3个COMT基因cDNAs,ChCOMT1(GenBank登录号为FJ479708)、GhCOMT2(GenBank登录号为FJ479709)和GhCOMT3(GenBank登录号为FJ848869)分别具有1 101 bp,1 098 bp、1 071 bp的开放阅读框,各自编码366、365和356个氨基酸.GhCOMT1、GhCOMT2和GhCOMT3在棉花各个组织中都有表达,GhCOMT1和GhCOMT2在根部的表达量最高,GhCOMT3在茎中表达量最高.SDS-PAGE电泳分析表明,3个蛋白的最佳诱导表达条件均为0.2 mmo1.L~(-1)IPTG在37℃下诱导6h.[结论]从棉花中克隆了3个木质素合成关键酶基因ChCOMT1、GhCOMT2和GhCOMT3,为进一步的生物学功能研究及其应用奠定了基础.