核桃NBS类抗病基因类似物的序列特征及其与炭疽病的抗性

摘要

[目的]利用同源序列法分离核桃的NBS (Nucleotide binding site)类抗病基因类似物,为核桃抗炭疽病分子辅助育种及抗病基因的克隆提供基础.[方法]以35个核桃优系为试材,利用接种法鉴定供试材料对炭疽病的抗性;根据已知植物抗病基因的保守结构域P-loop和GLPL设计简并引物,以核桃优系的基因组DNA为模板,通过PCR扩增NBS类抗病基因同源序列片段,并分析所得NBS类抗病基因类似物与核桃优系炭疽病抗性的关系;利用BLASTN/X程序对所得NBS序列在GenBank数据库中进行同源性搜索;利用MEGA 5.2及DNAman 7.0等软件对其进行序列相似性分析和系统进化研究.[结果]35个供试核桃优系中,有20个优系为抗炭疽病类型(R),其相对抗性指数在0.63-0.82;有5个优系为中抗类型(M),相对抗性指数在0.27-0.56;有1 0个为感病类型(S),相对抗性指数在0.00-0.21. PCR结果显示,从20个抗炭疽病优系的基因组扩增得到20条NBS类抗病基因类似序列;而在其它1 5个优系(5个中抗优系和1 0个感病优系)中未扩增到条带,表明核桃NBS序列与炭疽病抗性相关联.BLASTN显示,所得NBS序列在核苷酸水平与GenBank中已知的核桃NBS序列(jrRGAPGs)存在89％-100％同源性,与其它物种NBS序列的同源性在69％以上;BLASTX显示,所得NBS序列与已知核桃NBS抗病蛋白同源性为77％-99％,与其它物种的NBS抗病蛋白同源性在49％-66％°氨基酸序列多重比对分析表明,所得核桃NBS序列均包含有抗病基因所具有的典型功能域,如P-loop、kinase-2、kinase-3和GLPL等,在典型功能域的核苷酸多态性(Pi)明显低于非保守区,有较高保守性.系统发育分析表明,在核苷酸水平上可将所得核桃优系的NBS序列区分为7类,在氨基酸水平上可分TIR和non-TIR两大类7个亚类;所得核桃NBS序列非同义替换率(dN)和同义替换率(dS)的比值dN/dS在0.00-0.95,为纯化选择.氨基酸序列相似性表明核桃优系不同NBS亚类间的相似度为28.3％-63.5％,与已知抗病基因相应区域的氨基酸相似性为22.0％-48.5％°[结论]核桃NBS类抗病基因类似物与炭疽病抗性相关联,NBS序列与其他物种抗病基因有较高同源性,包含抗病基因保守的功能域,在进化上为纯化选择.