观赏向日葵NBS类抗病基因类似物的克隆与分析

摘要

向日葵(Helianthus annuus)可供油用及食用，亦为观赏或维护生态景观之最佳作物。向日葵感染病害对其产量、质量和观赏效果都会产生很大的影响。目前，对于植物病害的防治通常采用抗病品种及农药防治相结合的方法，但许多植物品种往往只具有单一抗性，而农药防治对人类的健康和生活环境却存有着巨大的潜在威胁。随着生物技术的不断发展，运用转基因技术进行植物品种的改良已被应用到农作物的生产中，因此植物抗病基因的克隆对于抗病遗传育种及抗病机制的深入研究具有重要的意义。 本论文的研究内容包括：(1)根据已知植物抗病基因NBS区的保守氨基酸结构域(P-loop和GLPL)设计简并引物，以抗病性好的观赏向日葵品种“Valentine”(浅黄色舌状花，深紫色管状花)的基因组DNA为模板，PCR扩增其NBS类抗病基因类似物(Resistance gene analogs，RGAs)，并对RGAs进行生物信息学分析，揭示观赏向日葵抗病基因的多样性及进化关系；(2)利用获得的观赏向目葵RGAs设计特异引物，对所收集的观赏向日葵及油葵品种进行特异性比较分析；(3)对获得的观赏向日葵SFRGA-3片段进行Southern杂交分析。主要研究结果如下： 1.从观赏向日葵品种“Valentine”基因组DNA中扩增出24条具有连续开放阅读框(ORF)的RGAs，分别命名为：SFRGA1～SFRGA24，登陆号：EU352826～EU352849。序列分析结果表明；24条RGAs编码的氨基酸均含有典型NBS-LRR类抗病基因所拥有的保守结构域P-loop、Kinase-2a、Kinase-3a和疏水结构域(HD)。同源性搜索表明，其中9条序列与向日葵属上已克隆的抗病类似蛋白有很高的同源性，其它15条序列搜索出某些植物上已克隆的抗病基因及许多得分较高的抗病类似蛋白序列，其中包含有很多未知基因。24个RGA核苷酸序列间的相似性在41.1％～99.6％之间变化，氨基酸序列间的相似性在25.8％～100％间变化。对分离到的RGAs进行系统发育树分析，无论是核苷酸序列还是氨基酸序列都明显地分为TIR-NBS-LRR和nonTIR-NBS-LRR两类。 2. 利用获得的RGA设计了3对特异性引物，其中RGA8-F1与RGA8-R1、RGA16-F1与RGA16-R1能够在各向日葵品种基因组DNA中扩增出与对照相应大小的片段；而RGA3-F1与RGA3-R1则未在观赏向日葵品种Sonja中扩增出条带来，可能缺失了SFRGA3片段，也可能是该品种的SFRGA3片段中已有部分核苷酸序列发生了突变或者发生重排。 3.用限制性内切酶BamH I、EcoR I、Kpn I分别对观赏向日葵Valentine基因组进行酶解，地高辛标记SFRGA3，并以此为探针进行了Southern杂交。结果表明，SFRGA3在Valentine基因组中有1-3个拷贝。

目录

声明

摘要

1引言

2植物抗病基因的研究进展

2.1植物抗病瓜的理论学说及其机理

2.1.1基因对基因假说

2.1.2病原的无毒基因

2.1.3植物的防卫反应

2.1.4植物的防卫基因

2.2植物抗病基因的克隆

2.2.1相关克隆及已克隆的植物抗病基因

2.2.2植物抗病基因的结构、功能特点

2.2.3植物抗病基因同源序列研究进展

3材料与方法

3.1实验材料

3.1.1植物材料

3.1.2供试菌种和质粒

3.1.3引物设计

3.1.4主要分子生物学及生化试剂

3.1.5主要仪器设备

3.2方法

3.2.1观赏向日葵基因组DNA的提取方法

3.2.2DNA浓度测定和质量检测

3.2.3观赏向日葵抗病基因类似物PCR扩增的反应体系及条件

3.2.4观赏向日葵抗病基因类似物PCR产物目的片段回收

3.2.5观赏向日葵抗病基因类似物PCR产物目的片段克隆

3.2.6观赏向日葵抗病基因类似物PCR产物的序列测定

3.2.7观赏向日葵抗病基因类似物多样性及进化关系分析

3.2.8观赏向日葵抗病基因类似物特异标记

3.2.9SFRGA3的Southern杂交

4结果与分析

4.1观赏向日葵NBS类抗病基因类似物的分离与鉴定

4.2观赏向日葵抗病基因类似物核苷酸序列的聚类分析

4.3观赏向日葵抗病基因类似物氨基酸序列的聚类分析

4.4观赏向日葵抗病基因类似物核苷酸序列同源性搜索

4.5观赏向日葵抗病基因类似物氨基酸序列同源性搜索

4.6观赏向日葵RGAs与已知的植物抗病基因相应区域的氨基酸序列相似性比较

4.7观赏向日葵抗病基因类似物特异标记分析

4.8SFRGA3的Southern杂交分析

5讨论

5.1观赏向日葵抗病基因类似物的分离与鉴定

5.2观赏向日葵抗病基因类似物的多样性及进化关系分析

6小结

参考文献

附录

致谢