桑树NBS类抗病基因的克隆与表达分析

摘要

由青枯劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum）所引起的桑树青枯病是一种土传性的毁灭性的病害，难以用化学方法进行有效防治，选育并合理利用抗病品种是防治该病最经济、有效和环境安全的方法。然而采用常规育种方法选育抗病品种存在育种周期长、效率低等不少缺点。因此，采用生物技术进行分子育种是当前较为有效的方法，而抗病基因的克隆是分子育种的基础。
　　本实验根据已获得的桑树转录组序列获得NBS类抗病基因序列片段，并设计特异性引物，以桑树cDNA为模板，结合cDNA末端快速扩增技术（RACE），进行NBS类抗病基因的全长克隆；同时利用青枯菌侵染桑树抗/感性品种，分析抗病基因在抗/感性品种侵染前后的表达量变化情况。主要研究结果如下：
　　1.桑树N BS类抗病基因同源片段的克隆：通过查找桑树转录组序列数据库，筛选出5个NBS类家族基因。通过设计引物，在桑树中成功克隆到了5个NBS类基因（CL93、Unigene14278、Unigene26173、Unigene32704、Unigene31320）的序列片段。
　　2.采用RAC E技术分别克隆CL93的3’、5’片段，成功获得了CL93的全长序列，共2109 bp。该基因包含1848 bp的开放阅读框，编码615个通读的蛋白质氨基酸序列，该基因编码蛋白产物可能具有N BS、LRR等保守结构域。
　　采用RACE技术分别克隆Unigene14278的3’、5’片段，成功获得了Unigene14278的全长序列，共1467 bp。该基因包含1170 bp的开放阅读框，编码390个通读的蛋白质氨基酸序列。
　　3.利用荧光定量分析方法，分析上述获得的5个N BS类基因在抗/感病品种侵染后基因表达。结果显示，CL93基因在感病品种中受青枯菌诱导表达，而在抗病品种中受青枯菌抑制表达，表明CL93基因可能跟抗病相关；Unigene26173基因在抗/感病品种中都受青枯菌表达，但抗病品种中的诱导显著高于感病品种，表明Unigene26173基因可能跟抗病有一定相关性。Unigene14278、Unigene32704、Unigene31320基因在抗/感病品种中都受青枯菌诱导，但在抗/感病品种中差异不显著。

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缩写词表

第1章 绪 论

1. 1 桑树青枯病

1. 2 植物抗病基因的结构与功能鉴定

1. 3 NBS类抗病蛋白的结构及功能

1.4 RACE技术

1. 5 实时荧光定量P CR

1. 6 研究目标与主要研究内容

第2章 桑树NBS类抗病基因的克隆

2. 1 材料、试剂及仪器

2. 2 实验方法

2. 3 结果与分析

2. 4 讨论

2. 5 本章小结

第3章NBS类抗病基因的诱导表达分析

3. 1 材料与方法

3. 2 实验方法

3. 3 结果与分析

3. 4 讨论

3. 5 本章小结

结论

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文

本论文研究受到下列项目的资助

致谢