葡萄类钙调磷酸酶B亚基互作蛋白激酶VvClPK10的特性与表达

摘要

[目的]在葡萄中克隆丝苏氨酸蛋白激酶VvCIPK10,分析其激酶特性和在逆境胁迫下的表达模式,为进一步研究该基因参与逆境胁迫的分子功能,探讨葡萄抗逆分子机制提供理论依据.[方法]利用电子克隆技术获得VvCIPK10序列,设计特异引物进行RT-PCR反应,对克隆到的序列进行开放阅读框和保守结构域分析;构建原核表达载体,转化表达菌株后用IPTG进行诱导表达,收集菌体后裂解细胞,制备蛋白上样液,SDS-PAGE电泳对表达产物进行分析,同时对融合蛋白进行可溶性分析;IPTG大量诱导表达融合蛋白,收集菌体后进行超声破碎细胞,用麦芽糖结合蛋白纯化柱纯化MBP-VvCIPK10融合蛋白,SDS-PAGE电泳进行分析;纯化后的融合蛋白与体外自磷酸化缓冲液进行自磷酸化反应,反应后SDS-PAGE电泳,压磷屏检测体外自磷酸化反应;构建重组瞬时表达载体pBI221-GFP/VvCIPK10;分离拟南芥原生质体,通过PEG介导的瞬时转化方法将重组表达载体pBI221-GFP/VvCIPK10转化至原生质体;通过基因枪介导的转化方法将重组表达载体pBI221-GFP/VvCIPK10转化至洋葱表皮细胞,培养16h后用激光共聚焦显微镜进行荧光信号检测;选择生长相对一致且健壮的葡萄植株,于干旱、低温和盐胁迫处理后不同时间取样,同时在田间取葡萄不同组织样品,实时荧光定量PCR检测VvCIPK10在葡萄不同组织中的表达以及在不同逆境胁迫下的表达模式.[结果]PCR克隆获得葡萄VvCIPK10全长为1 357 bp,5'端非编码区为30 bp,3'端非编码区为156 bp,开放阅读框为1 171 bp,编码436个氨基酸,理论等电点为8.59,分子量为48.7 kDa.保守结构域预测分析显示该蛋白5'端具有一个激酶结构域,3'末端具有一个PPI结构域和一个NAF结构域.BLSATP分析表明葡萄VvCIPK10与桃树CIPK (XP_007205151)一致性最高(74％).重组表达载体pMAL-C5X/VvCIPK10在大肠杆菌中经诱导表达获得与理论分子量(43 kDa+48.7 kDa)相一致的融合蛋白.MBP-VvCIPK10融合蛋白经柱纯化后获得单一的蛋白条带,VvCIPK10的自磷酸化活性依赖于Mn2+,不依赖于Mg2+和Ca2+,EDTA可以抑制VvCIPK10的自磷酸化活性.亚细胞定位结果显示,VvCIPK10定位在细胞核、细胞膜和细胞质.VvCIPK10在葡萄各个组织中均有表达,主要在葡萄根和叶片中大量表达,葡萄茎、花序、果实和卷须中的表达量较低.在干旱、低温和盐胁迫处理后,VvCIPK10呈现受诱导表达模式.VvCIPK10的表达在低温胁迫后6h达到峰值,干旱和盐胁迫后2h即达到峰值.[结论]葡萄VvCIPK10能够响应干旱、低温和盐胁迫,推测VvCIPK10在葡萄抗非生物逆境胁迫中具有重要作用.